還原糖含量測定(砷鉬酸比色法)
一、目的
植物 體內(nèi)的還原糖主要是葡萄糖、果糖和麥芽糖。它們在植物體內(nèi)的分布，不僅反映植物體內(nèi)碳水化合物的運轉(zhuǎn)情況，而且也是合成其它成分碳架來源和呼吸作用的基質(zhì)。此外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鑒定其品質(zhì)的重要指標(biāo)。其它碳水化合物，如淀粉、蔗糖等，經(jīng)水解也生成還原糖。因此，測定還原糖的方法在研究植物體內(nèi)生理生化變化和測定植物體內(nèi)碳水化合物方面都是很重要的。
二，原理；
還原糖是具有羰基（>C=O）的糖，能將其它物質(zhì)還原而其本身被氧化。
(1) 還原糖在堿性條件及有酒石酸鉀鈉存在下加熱，可以定量地還原二價銅離子為一價銅離子，產(chǎn)生磚紅色的氧化亞銅沉淀，其本身被氧化。具體反應(yīng)如下：
（2）氧化亞銅在酸性條件下，可將鉬酸銨還原，還原型的鉬酸銨再與砷酸氫二鈉起作用，生成一種藍(lán)色復(fù)合砷鉬藍(lán)，其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與還原糖的含量（即被還原的Cu2O 量）成正比，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖與砷鉬酸作用，比色后做標(biāo)準(zhǔn)，就可測得樣品還原糖含量。
三、實驗材料、主要儀器和試劑
1．實驗材料
蘋果、面粉等
2．主要儀器
（1）分光光度計
（2）水浴鍋
（3）具塞刻度試管：20mL×10
（4）刻度吸管：1 mL×1，2 mL×4，5 mL×3
（5）容量瓶：100 mL×2
（6）漏斗
（7）研缽
3．試劑
（1）銅試劑：
A、4％CuSO45H2O
B、稱取24g 無水碳酸鈉，用850mL 水溶于大燒杯中，加入2g 含4 分子 結(jié)晶水的酒石酸鉀鈉，待全溶（應(yīng)加熱）后加入碳酸氫鈉16g，再加入120g 無水硫酸鈉（加熱），全溶及冷卻后加水至900mL，沉淀1～2d，取上清液（要求嚴(yán)格時過濾）備用。使用前將A 與B 按1∶9 混勻即可使用。
（2）砷鉬酸試劑：25g 鉬酸銨 ( NH4)6Mo7O24·4H2O 溶于450mL 蒸餾水中（加熱溶解，但溫度接近150℃時易分解），待冷卻后再加入21mL 濃H2SO4 混勻。另將3g 砷酸氫二鈉(Na2HasO4·7H2O)溶解于25mL 蒸餾水中，然后加到鉬酸銨溶液中，室溫下放置于棕色瓶中可長期使用。
（3）200μg／mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖原液：準(zhǔn)確稱取分析純葡萄糖200mg，溶解定容到1000mL。
四、操作步驟
1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：
在一系列刻度試管中，分別加入200μg／mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5及0.6 mL，再順序加入蒸餾水2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5 及1.4 mL，配成濃度分別為0、10、20、30、40、50 及60μg/mL 的系列葡萄糖溶液。每試管加入銅試劑2mL，混勻后沸水浴中加熱10min，立即冷卻，再加入2mL 砷鉬酸試劑，振蕩兩分鐘后稀釋到20mL，用分光光度計在620nm 波長下比色，測其光密度OD620nm（做一式兩份）。以糖濃度微克數(shù)為橫坐標(biāo)，光密度OD620nm 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2．植物樣品中還原糖的提取：
將樣品洗凈，吸干其表面水分，切碎混勻，稱取1g 放入研缽中，加入約0.5g 石英砂，磨成勻漿，加水將樣品由玻璃漏斗沖入100mL 容量瓶中，加水達(dá)70～80mL，搖勻后置于80℃恒溫水浴上浸提0.5h。
待上述樣品冷卻后，沉淀蛋白質(zhì)，加入5％硫酸鋅5mL，再慢慢滴入0.3mol/L Ba(OH)2 5mL，以沉淀蛋白質(zhì)。振蕩后靜置，至上層出現(xiàn)清液后再加一滴Ba(OH)2，直至無白色沉淀時，向容量瓶加水至刻度。
3．還原糖含量的測定：
過濾上述已定容的樣品液，取5mL 濾液，再定容到100mL（此步視樣品的含糖量而定）。取已稀釋的溶液2mL，與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖顯色法相同：加銅試劑2mL，煮沸10min，加砷鉬酸試劑2mL，振蕩2mL，定容到15ml，620nm 波長下比色，記下光密度OD620nm（至少重復(fù)兩次）。
五，結(jié)果計算
式中：G 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得含糖量（μg）
W 樣品重（g）
六、思考題
舉例說明哪些是還原糖？
參考答案：
還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中果糖、乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖、淀粉和纖維素等是非還原糖。
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