扣除雜交(subtractive hybridization)
扣除雜交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，它是通過構建扣除文庫(subtractive library)得以實現的。差別雜交對于因特殊處理而被誘發產生的mRNA之cDNA克隆的分離，或是在細胞中具高表達效率的mRNA之cDNA克隆的分離，無疑是一種有效的方法，但對于低豐度的mRNA之cDNA克隆的分離則有相當的困難。為了進一步提高差別雜交的篩選效率，一種切實可行的辦法是構建富含目的基因序列的cDNA文庫。應用扣除雜交篩選法便可達到此種目的。
扣除雜交法的本質是除去那些普遍共同存在的、或是非誘發產生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分離的敏感性。下面以T細胞受體(T-cellreceptor，TCR有時亦稱之為T細胞抗原受體)編碼基因的分離為例子，說明扣除雜交篩選法的基本原理與簡要過程。T細胞和B細胞來自共同的前體細胞，兩者都能夠識別特異的抗原。但與B細胞不同，T細胞不能識別游離的抗原，而只能識別展現在其它細胞表面的抗原。T細胞的這種抗原識別特異性是由TCR基因決定的。
TCR基因只能在T細胞中表達，而不能在B細胞中表達。那么從T細胞mRNA制備來的單鏈cDNA，同大大超量的B細胞的mRNA在有利于發生DNA~RNA雜交的條件下保溫，其結果便會出現這樣的情況：所有的能夠在T和B兩類細胞中同時表達的T細胞基因的cDNA分子(約占98％)，都能與B細胞的mRNA退火形成DNA—RNA雜交分子，而不能在B細胞中表達的、T細胞特有的cDNA(約占2％)，由于B細胞中沒有相應的mRNA，故不能形成DNA—RNA雜交分子，仍然處于單鏈的狀態。將此種雜交混合物通過羥基磷灰石柱(hydroxylapatitecolumn)，于是DNA—RNA雜交分子便結合在柱上，而游離的單鏈cDNA則過柱流出。如此回收到的T細胞特異的cDNA被轉變為雙鏈eDNA之后，與適當的λ噬菌體載體重組井轉染給大腸桿菌寄主細胞，這樣便得到了T細胞特異eDNA高度富集的扣除文庫。然后再按照同樣方法制備扣除的eDNA探針，即被B細胞mRNA雜交扣除了的T細胞特異的cDNA探針，篩選文庫，結果成功地分離到了T細的TCR基因。
扣除雜交法同樣也可以用來分離缺失突變基因。從野生型植株制備的染色體總DNA，用一種適當的核酸內切限制酶[比如Sau3A]切割成小片段。同時從缺失突變體植株制備的染色體總DNA，經隨機切割之后，用生物素(biotin)進行標記，供作非同位素標記探針使用。取大大超量的此種探針，同Sau3A酶切的野生型染色體總DNA片段混合，經變性、退火處理，溶液中的無生物素標記的野生型的DNA分子便同生物素標記的突變型的DNA探針雜交。將雜交反應混合物通過生物素結合蛋白質柱(avidincolumn)。這種柱是用包裹著生物素結合蛋白質的專用的細小磁珠裝填的。大部分野生型植株的DNA分子都同突變型植株的生物素標記的DNA探針雜交，便被結合到柱上。而野生型植株的DNA片段月，由于在突變型DNA中缺失了相應的片段，故沒有相應的生物素標記的探針與之雜交，經洗脫便過柱流出。隨后將洗脫收集的DNA同超量的生物素標記探針再雜交，再過柱。如此經過多次重復富集之后，用PCR法擴增DNA片段月，并予以克隆。最后用Southern雜交法進一步鑒定出，只同野生型DNA雜交而不能同突變型DNA雜交的含有突變基因的陽性克隆。
北京天優福康生物科技有限公司
官網：http://m.jyzjsd.com/
服務熱線：400-860-6160
聯系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
