反向酵母雙雜交系統(tǒng)
確定了蛋白之間的相互作用后， 更重要的工作是研究其功能、結(jié)構(gòu)及其作用的條件調(diào)節(jié)。鑒定在相互作用的一對蛋白中的任一蛋白突變對其相互作用的抑制作用， 不僅有助于探索相互作用的結(jié)構(gòu)單位， 而且可作為研究體內(nèi)功能的遺傳學(xué)方法。這對于多個作用分子的蛋白就更為重要。 1996年Vidalix x等建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng)(reverse two-hybrid system)， 提供了簡便的鑒定阻斷蛋白間相互作用的方法。反向酵母雙雜交系統(tǒng)的關(guān)鍵是摻入一種表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞生長有毒的報(bào)導(dǎo)基因， 用于監(jiān)測蛋白間的相互作用。例如酵母URA3基因表達(dá)產(chǎn)物是尿嘧啶合成所必需的， 同時它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)。Vidal等構(gòu)建了一酵母細(xì)胞株， 其URA3的表達(dá)由含GAL4結(jié)合位點(diǎn)的啟動子嚴(yán)密控制。此細(xì)胞株在缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基中培育需要GAL4激活結(jié)構(gòu)域(GAD)和GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GBD)的融合蛋白的相互作用的表達(dá)。而在含5-FOA的完全培養(yǎng)基中則受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。因此可通過篩選5-FOA抗性克隆從隨機(jī)突變庫中鑒定阻斷蛋白相互作用的突變體。
反向雙雜交系統(tǒng)可更有效地蛋白間作用的關(guān)鍵位點(diǎn)或起決定作用的個別氨基酸， 進(jìn)而分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。此外此系統(tǒng)還可篩選能阻止某些蛋白間相互作用的肽或小分子物質(zhì)用作臨床治療制劑。
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