親和層析法純化胰蛋白酶
一、實驗目的
1.熟悉親和層析 純化蛋白質的的原理。
2.初步掌握親和層析法純化胰蛋白酶的方法步驟。
二、實驗原理
親和層析已經廣泛應用于生物分子的分離和純化，如結合蛋白、酶、抑制劑、抗原 、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸及多糖類等，也可用于分離細胞、細胞器、病毒等。近十多年來，親和層析發展十分迅速，尤其是對那些分離流程長、難度大、濃度低、雜質多，采用常規方法難以進行分離的生物分子來說，親和層析顯示出其獨特的優越性。
親和層析主要是根據生物分子 與特定的固相化配基之間的親和力而使生物分子得到分離。它是由吸附層析衍生、發展起來的分離技術。利用親和層析載體固相化配基與親和互補物之間通過范德華力、疏水力、靜電力、氫鍵作用等發生專一性的結合而進行分離。這種有選擇性地結合主要歸結于固相化配基與親和互補物二者之間的生物學特性和特異的化學結構以及空間構象。在親和層析過程中，被純化的生物分子在一定的條件下，選擇性地結合到被共價偶聯到不溶性載體上的配基上，然后改變原有的條件，如洗脫液的PH 值、離子強度、有機溶劑的濃度等，有選擇性地從載體上把被分離物洗脫下來。通過親和層析法分離的物質，其純度、活性回收率及純化倍數均較高。
親和層析的載體要選用機械強度高、非特異性吸附少、水不溶性的、具有較多化學反應基團—羥基的多糖類介質，該載體在溫和條件下與配基共價偶聯，而又不影響配基及被分離物質原有的生物學特性。
1967年Porath 和Ernback 報道了采用溴化氰可將含有氨基的有機分子偶聯到多糖基上，使得親和層析技術向前推進了一大步。直到目前，溴化氰活化載體還是用得最多，效果最好的活化方法。1971年Porath 又報道了應用環氧氯丙烷在堿性條件下活化載體的方法，克服溴化氰由于劇毒給操作帶來的不便，使活化載體的方法簡便易行，親和層析技術得到廣泛的應用。
目前可用于活化載體的活化劑有幾十種之多，但常用的是溴化氰、環氧氯丙烷、1．4—丁二醚、戌二醛等。采用環氧氯丙烷為活化劑，sepharose 4B 為載體，雞卵類粘蛋白為配基可合成適用于分離胰蛋白酶的親和吸附
劑。載體活化及偶聯反應如下：
1. 環氧氯丙烷活化載體與配基偶聯
2. 溴化氰活化載體與配基偶聯
上述反應，除了氨基能偶聯外，也能與巰基發生偶聯反應。
另一種與配基的偶聯方式是插入”手臂”。在親和層析中如果要以一個小分子作為配基(如胺類)，而被分離物(親相互補物)又是一個大分子，二者在結合過程中就會受到空間阻礙，影響結合效果。因此，必須在載體和配基之間引入一段”手臂”，即再接上一段有機分子，使載體上的配基向外擴展伸長以增強配基和互補物之間的接觸面，減少空間位阻，提高親和層析的結合效率。合成過程要經過載體活化，接”臀”、活化及連接配基等操作步驟。
目前常用的載體是瓊脂糖膠粒。它具有機械強度高、透性好、載體本身非特異性吸附少等優點。除此以外，其他可用作載體的材料還有纖維素、葡聚糖凝膠(SePhadex)、多孔硅膠、樹脂等。但是它們都具有不同程度的非特異性吸附，因此目前使用的并不多。
北京天優?？瞪锟萍加邢薰?/span>
官網：http://m.jyzjsd.com/
服務熱線：400-860-6160
聯系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
