細(xì)菌的保存方法與無菌操作

細(xì)菌的保存方法

1。細(xì)菌保存于穿刺培養(yǎng)物中：一般細(xì)菌保存于穿刺培養(yǎng)物可以維持兩年。具體方法如下：用滅菌接種針挑取分散良好的單菌落，針緩慢穿過瓊脂到達(dá)瓶底，連續(xù)幾次，蓋上瓶蓋擰緊，做好標(biāo)記。室溫下存放于暗處。（最好一點(diǎn)可以將瓶蓋放松，在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)過夜，再擰緊瓶蓋并加封Parafilm膜，室溫或最好在4度避光保存）。
2。細(xì)菌保存于含有甘油的培養(yǎng)物中：
（1）：在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物：取0.85ml細(xì)菌培養(yǎng)物，加入0.15ml高壓滅菌甘油，振蕩培養(yǎng)物使甘油分布均勻，然后轉(zhuǎn)移到標(biāo)記好的保存管內(nèi)，密封，在乙醇－干冰或液氮中凍結(jié)后再轉(zhuǎn)至－70度長(zhǎng)期保存。在復(fù)蘇時(shí)，用滅菌接種針刮取凍結(jié)的培養(yǎng)物表面，然后立即把黏附于接種針上的細(xì)菌劃于含適當(dāng)抗生素的LB瓊脂平板表面，于37度過夜。
（2）：在瓊脂平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物：從瓊脂平板表面刮下細(xì)菌放入裝有2mlLB的無菌試管內(nèi)，再加入等量的含有30％滅菌甘油的LB培養(yǎng)基，振蕩使甘油完全分布均勻后，分裝于無菌保存管內(nèi)，密封，再按前述方法冰凍保存。這一方法的優(yōu)點(diǎn)在于可用于保存在質(zhì)粒載體上建立的cDNA文庫(kù)。

菌種保存方法
微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。
　　低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的。
　　保藏方法大致可分為以下幾種：
　　1．傳代培養(yǎng)保藏法
　　又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用），培養(yǎng)后于4—6℃冰箱內(nèi)保存。
　　2．液體石蠟覆蓋保藏法
　　是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當(dāng)延長(zhǎng)保藏時(shí)間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。
　　3．載體保藏法
　　是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。
　　4．寄主保藏法
　　用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。
　　5．冷凍保藏法
　　可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
　　6．冷凍干燥保藏法
　　先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。
　　有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對(duì)細(xì)胞的損害。保護(hù)性溶質(zhì)可通過氫和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。保護(hù)劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等。
　　三、器材
　　細(xì)菌、酵母菌，放線菌和霉菌；
　　肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，滅菌脫脂牛乳，滅菌水，化學(xué)純的液體石蠟，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黃土或紅土，冰塊、食鹽，干冰，95％酒精，10％鹽酸，無水氯化鈣；
　　滅菌吸管，滅菌滴管，滅菌培養(yǎng)皿，管形安瓿管，淚滴形安瓿管（長(zhǎng)頸球形底），40目與 100目篩子，油紙，濾紙條（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空壓力表，噴燈，L形五通管，冰箱，低溫冰箱（-30℃），液氮冷凍保藏器。
　　四、操作步驟、各保藏法的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)
　　下列各法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件與需要選做。
　　1．斜面低溫保藏法
　　將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長(zhǎng)后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。
　　保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2—4個(gè)月，移種一次。酵母菌兩個(gè)月，細(xì)菌最好每月移種一次。
　　此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法，優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，使用方便，不需特殊設(shè)備，能隨時(shí)檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會(huì)使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機(jī)會(huì)亦較多。

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