固相pH梯度-SDS雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)操作程序

實(shí)驗(yàn)原理：

第一向等電聚焦的基本原理是利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子的等電點(diǎn)不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。第二向運(yùn)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)分子量大小對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。

基本過(guò)程：等電聚焦、平衡及轉(zhuǎn)移到二向、SDS-PAGE

試劑 或儲(chǔ)液：IPG buffer、礦物油、DTT、碘代乙酰胺、過(guò)硫酸銨、TEMED、1M DTT、rehydration buffer、平衡液儲(chǔ)液、30%丙烯酰胺單體儲(chǔ)液、1.5M Tris-HCl、10% SDS、10X Tris-甘氨酸系統(tǒng)的電泳緩沖液、0.5% 瓊脂 糖、水飽和正丁醇、占位液

實(shí)驗(yàn)操作程序：

等點(diǎn)聚焦部分

1．根據(jù)選用的膠條的長(zhǎng)度計(jì)算上樣體積（見(jiàn)附1），加1M DTT到終濃度50mM需要的體積，補(bǔ)加IPG buffer到終濃度0.2%或者0.5%的體積，加rehydration buffer到該膠條的上樣體積。

2．把各種溶液按計(jì)算的體積加入到eppendorf管中，充分混勻，（或者超聲5-10min）14000rpm,10℃離心5min。

3．取出膠條室溫放置10min，平衡膠條的溫度。

4．沿著聚焦盤中槽的邊緣從左至右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡，否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。

5．當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤中后，用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。

6．分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有+，安瑪西亞膠條為尖端）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極（安瑪西亞為尖端）。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。

7．在每根膠條上覆蓋1-3ml礦物油，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)析出尿素。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。

8．對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序（見(jiàn)附2）。

9．聚焦結(jié)束的膠條立即進(jìn)行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條吸干礦物油置于平衡管中，-80℃冰箱保存。

注意事項(xiàng)：

參見(jiàn)“雙向電泳培訓(xùn)班講義（定稿）”中等電聚焦注意事項(xiàng)部分。

附1：

膠條長(zhǎng)度、上樣量、上樣體積、等點(diǎn)聚焦的伏小時(shí)數(shù)的設(shè)置及說(shuō)明

說(shuō)明：
1．pH3-10NL, pH4-7, pH6-11的上樣量與pH 3-10相比增加1.5-2倍，聚焦伏小時(shí)數(shù)延長(zhǎng)約10000VHr
2．按照推薦量上預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整上樣量，樣品中蛋白質(zhì)分布均勻按推薦量使用，如果有高豐度的蛋白質(zhì)適當(dāng)降低上樣量，如果顯得少則適當(dāng)加大上樣量。聚焦的伏小時(shí)數(shù)可以根據(jù)聚焦的情況進(jìn)行調(diào)整。

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