目的序列與載體的連接

將目的基因或序列插入 載體 ，主要靠DNA連接酶和雙鏈DNA粘末端單鏈序列互補結(jié)合的配合使用。有以下主要的方式。

一、粘性末端連接

　　如果目的序列兩端有與 載體 上相同的限制性核酸內(nèi)切酶位點，則同一限制酶切開產(chǎn)生的粘末端，在降低溫度退火時，能重新互補結(jié)合，在DNA連接酶催化下，目的序列就與載體DNA鏈相連接（見圖20-5）。

不同的限制性內(nèi)切酶切，如果產(chǎn)生的DNA的粘末端相同，也同樣可用此法連接，如識別6bp序列的BamHⅠ和識別4bp序列的Sau3aⅠ切割DNA后都產(chǎn)生5’突出粘性末端GATC，可以互補結(jié)合連接。

如果在連接的兩個DNA片段沒有能互補的粘性末端，可用末湍核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化脫氨單核苷酸添加DNA的3’末端，例如一般DNA3’端加上polyG，另一股DNA加上polyC，這樣人工在DNA兩端做出能互補的共核苷酸多聚物粘性末端，退炎后能結(jié)合連接（圖20-6），這樣方法稱為同聚物加尾法。

對平末端的DNA，也可先連上人工設(shè)計合成的脫氧寡核苷酸雙鏈接頭，使DNA末端產(chǎn)生新的限制內(nèi)切酶位點，經(jīng)內(nèi)切酶割后，即可按粘性末端相連（圖20-7）。

二、平末端連接

T4DNA連接酶也能催化限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生DNA平末端的連接。如果目的序列和載體上沒有相同的限制性內(nèi)切酶位點可供利用，用不同的限制性內(nèi)切酶切割后的粘性末端不能互補結(jié)合，則可用適當(dāng)?shù)拿笇NA突出的末端削平或補齊成平末端，再用T4DNA連接酶連接，但平末端連接要比粘性末端連接的效率低得多。

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