膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)-蛋白-金復(fù)合體的制備
一般認(rèn)為膠體金粒子表面為一層 AuCl2 ，因此，粒子表面帶有負(fù)電荷，這種負(fù)電荷粒子之間相互排斥，形成穩(wěn)定懸浮的膠體金溶液。
金顆粒表面可以包被一層生物大分子（如蛋白）來穩(wěn)定和保護(hù)這些粒子，以免受外來電解質(zhì)的影響而相互凝聚在一起。膠體金粒子對蛋白的吸附作用取決于 pH 值，這是因蛋白的凈電荷取決于溶液的 pH 值，在 pH=pI 時為中性。由于在 pH=pI 時蛋白溶解度最小，因此這時它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在實(shí)際的膠體金探針制備中，一般膠體金調(diào)整為 pH=PI+0.5 ，這樣蛋白帶正電，有利于結(jié)合更穩(wěn)定。
膠體金探針?biāo)玫鞍妆仨氁?jīng)過前處理，其目的在于
（ 1 ）去除高濃度的鹽分，高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚，這一步往往采用低濃度緩沖液中進(jìn)行。
（ 2 ）使蛋白分子盡量分散為單體，凍干蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子，可同時與多個膠體金粒子結(jié)合，影響標(biāo)記的靈敏度和定量分析。
（ 3 ）使蛋白具有適當(dāng)?shù)姆肿恿俊５鞍追肿恿窟^小（ 30 kD ），形成的蛋白復(fù)合體往往是不穩(wěn)定，可短時間內(nèi)失活。而分子量過大時，被認(rèn)為影響探針的靈敏度，特別是已知蛋白的結(jié)構(gòu)與活性中心的情況下，去除對活性武影響的結(jié)構(gòu)部分是提高標(biāo)記靈敏度，延長探針壽命（防止凝集）的有效辦法。把分子量過小的蛋白與其它蛋白（如 BSA ，牛血清蛋白等）結(jié)合后，能制備出穩(wěn)定性更佳的探針。
當(dāng)?shù)鞍浊疤幚硗瓿珊螅又_定膠體金與蛋白結(jié)合的最佳 pH 值。對于理化性質(zhì)不確定的蛋白這一步尤為重要。過量的蛋白與不同 pH 值得膠體金結(jié)合后，只有某一特定 pH 值能夠形成結(jié)合最穩(wěn)定的探針。在高濃度電解質(zhì)（如 NaCl ）作用下不會凝聚。不同蛋白的適宜 pH 范圍的寬窄大不相同。一般選擇最小適宜 pH 值為最佳 pH 值。但有些探針的實(shí)際情況并不完全如此，最穩(wěn)定發(fā)探針并不完全代表活性最好。這要靠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
在確定最佳 pH 值后，最后要確定最小蛋白量，即能夠形成穩(wěn)定探針的蛋白的最小量。如果在制備探針時加入太多的蛋白，不僅造成浪費(fèi)，而且更為嚴(yán)重的是容易造成探針凝聚，并嚴(yán)重影響標(biāo)記活性。因?yàn)樘结樔芤褐械挠坞x蛋白容易搶先與標(biāo)記位點(diǎn)結(jié)合，起到“封閉”（ Blocking ）作用，而膠體金探針標(biāo)記不上。在標(biāo)記位點(diǎn)希少、被標(biāo)記物含量較少的情況下要特別注意。
這里需要特別指出的是，使用不同直徑的膠體金與同一蛋白結(jié)合時，除了蛋白量完全不同外，往往最佳 pH 也有一定變化。
因此，在探針制備每一環(huán)節(jié)應(yīng)隨時監(jiān)測探針對分布情況、負(fù)染結(jié)合及活性。
1 、抗血清的前處理
一般抗血清中 IgG 的含量為 10-25% ，而絕大部分為其它蛋白。用抗血清直接制備探針其標(biāo)記活性與特異性均不理想。因此需去除其中多數(shù)雜蛋白。但處理環(huán)節(jié)不宜太繁，在實(shí)驗(yàn)室設(shè)備與經(jīng)驗(yàn)缺乏的情況下更是如此，否則會導(dǎo)致 IgG 活性的大幅降低。如果你的實(shí)驗(yàn)室在蛋白純化方面有很強(qiáng)的技術(shù)支持，高度純化后效果會更好。
大量工作表明，只用硫酸銨沉淀就可以得到足夠純度及高活性的 IgG 蛋白。其基本步驟如下：
(1) 取抗血清 0.2 ml ；
(2) 加生理鹽水（ 0.85 ％ NaCl ） 0.3 ml ，混勻；
(3) 逐滴加入飽和 (NH4 )2 SO4 0.5 ml ，充分振蕩混勻， 4 ℃靜置 1 h ；
(4) 10000 rpm/min 離心 20 min ，棄上清；
(5) 加 0.5 ml 生理鹽水重懸浮，混勻；
(6) 逐滴加 0.25 ml 飽和 (NH4 )2 SO4 ，充分振蕩混勻， 4 ℃靜置 1 h ；
(7) 10000 rpm/min 離心 20 min ，棄上清；
(8) 重復(fù) 5 ～ 8 步驟一次；
(9) 加生理鹽水 0.5 ml 重懸浮，混勻；
(10) 生理鹽水中透析 12 ～ 24 h ；
(11) 在 0.2 M pH 9.0 硼酸緩沖液透析 12 ～ 24 h ；
(12) 分裝，即將使用時 4 ℃保存，備用 -20 ℃保存。
為最大限度保持抗體活性，整個過程應(yīng)在 4 ℃下進(jìn)行。對于凍干抗血清或長時間保存的血清，將生理鹽水透析改為 3 M KCNS 透析，促使聚合的多聚體解聚。如果抗血清效價較低時，不宜準(zhǔn)備膠體金探針。
2 、親和純化抗體的處理
親和純化抗體多是一些商品化的通用抗體，即二抗。一般為羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗體。這些抗體一般有兩個問題，一是 IgG 分子往往聚集為多聚體分子，二是往往含有較多的鹽分。因此前處理的目的在于脫鹽和解聚。
其基本步驟如下：
(1) 將親和純化抗體用生理鹽水稀釋為 0.5-1 mg/ml 濃度
(2) 在 3 M KCNS （硫氰酸鉀）溶液中透析 12 h
(3) 在 2 mMol pH 9.0 的硼酸緩沖液中透析 12 h （更換透析液數(shù)次）
(4) 分裝備用
其它蛋白可參考此方法進(jìn)行。但注意后一種透析液的 pH 值應(yīng)與交聯(lián)時 pH 值一致。在實(shí)際運(yùn)用中，一般省略去 3M KCNS 透析這一步，特別是當(dāng)?shù)鞍追肿恿枯^小，且為非糖蛋白時。我們建議在制備通用探針（如二抗 IgG ， Protein A ， Protein G ， Streptavidin ）等時，嚴(yán)格使用該方法，而制備直接標(biāo)記探針時，也可以忽略處理步驟。
3 、 IgG Fab 片段的制備
一般來說體積較小的探針具有相對較高的標(biāo)記活性。主要原因在于膠體金顆粒較小時有利于在標(biāo)記溶液中的擴(kuò)散運(yùn)動；在膠體金直徑一定時，蛋白分子量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位點(diǎn)也越密集，也容易于靶位點(diǎn)結(jié)合。
IgG 分子量為 150 kD 左右，由 4 個亞基組成，即兩條重鏈（ H ）和兩條輕鏈（ L ）。用水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到兩種片段，即 Fab 和 Fc 。其中 Fab 是具有抗原識別活性的部分，回收后制備探針。 Fc 能夠與 Protein A 和 Protein G 特異性結(jié)合。但這種分離只能在有條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
其基本過程如下：
(1) 用 PBS （ pH 7.0 ，含 10 mM EDTA ， 20 mM 鹽酸半胱氨酸）溶解純化的 IgG
(2) 加固化木瓜蛋白酶
(3) 37 ℃處理 5h
(4) 離心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀）
(5) 過 Protein G 柱
(6) 純化的 Fab 片段按前文方法做進(jìn)一步處理
注： Fab 與膠體金結(jié)合的 pH 值為 6.5
4 、蛋白與膠體金結(jié)合最佳 pH 測定
( 例纖維素酶， pI 未知 )
(1) 取若干個 1.5ml 試管，分別加入 1 ml 10 nm 膠體金；
(2) 用 25 mM K2 CO3 將 pH 分別調(diào)為 3 ， 4 ， 5 ， 6 ， 7 ， 8 ， 9 ， 10 ；
(3) 取一 96 孔培養(yǎng)板，按 pH 從低到高分別將上述膠體金分別取 100 m l 加入孔中，重復(fù)三次；
浙江大學(xué)電子顯微鏡室, 浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所
胡東維 洪 健 徐 穎
