DNA酶解及DNA片段瓊脂糖凝膠電泳

【目的要求】

1. 掌握限制性核酸內切酶概念、特點及作用原理，DNA酶解技術的應用

2. 掌握瓊脂 糖凝膠電泳分離DNA片段原理及其操作

3. 熟悉電泳基本原理及其影響因素

【教學內容】

1．限制性核酸內切酶概念、特點及作用原理，DNA酶解技術的應用

2．DNA片段瓊脂糖凝膠電泳

3．電泳概念、分類、應用、基本原理及其影響因素, 瓊脂糖凝膠制備、加樣、電泳及結果分析

【實驗】

一．DNA酶解原理：

1.限制性核酸內切酶：是一類能識別并水解雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶。一般能識別4-6個堿基對，并在特定位點切割。如：HindⅢ A↓A G C T T EcoRⅠ G↓A A T T C HpuⅡ C↓C G G2.酶單位數：在最適溫度、PH條件下，1小時完全水解1μgλDNA所需的酶量為1個單位。

試劑：

(1)λDNA（0.38μg/μl）

(2) HindⅢ (16u/μl)

(3) 酶解Buffer(Tris-HCl,NaCl,MgCl2,DTT )

(4) 反應終止液（溴酚藍1%，SDS 1%，EDTA 2%，甘油50%） 

方法：1. 取兩只EP管

（1）λDNA 10μl，雙蒸水 10μl 

（2）λDNA 10μl，HindⅢ 10μl 充分混勻 2. 37℃水浴2小時。

 3. 保溫結束后加入終止液5μl。

二. 瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段（水平潛水式）原理：

1． DNA含有PO43-基團，在pH7.5 Buffer中帶負電, 在電場中向正極移動。由于不同大小的DNA片段的電荷密度大致相同，自由電泳時，各核酸分子的遷移率區別很小，難以分開

2． 選用適當濃度的凝膠作為支持物，使之具備一定的孔徑，即可發揮分子篩效應（凝膠孔徑對大小不同的分子有不同的阻力），使大小不同的核酸片段遷移率出現較大差異，達到分離的目的，同樣條件對Maker電泳，對比觀察DNA酶解效果

3． DNA經溴乙錠（EB）染色，溴乙錠可以插入DNA雙螺旋結構兩個堿基之間，與核酸形成絡合物，在紫外（300nm,360nm）激發下，產生桔黃色熒光（590 nm可見光）。標準Maker經溴乙錠（EB）染色可以觀察到6條帶，分別為: 23Kb, 9.9Kb, 4.4Kb, 4.3Kb, 2.2Kb, 2.0Kb試劑：

（1）1%瓊脂糖

（2）TAE液

（3）Marker

（4）EB 方法：

1. 電泳儀接線：黑（負）—黑，紅（正）—紅

2．凝膠槽準備：用膠布固定膠槽兩側，調整梳子高度距離槽底2-3毫米，調好水平。

3．灌膠：

(1) 稱取0.8克瓊脂糖,加入80毫升TAE中,熱浴溶解至透明

(2) 60℃左右加入EB100μl(終濃度0.5μg/ml), 倒入備好的凝膠槽中。應注意膠面平整,無氣泡

(3) 冷卻后,拔去梳子4．加樣: (1) 去掉膠布，將灌好的膠板平放在電泳槽中 (2) 加入電極Buffer使之高出膠面(1-3毫米) (3) 用進樣器吸樣品20μl加入樣品槽中5．電泳: v = 100V, 1-1.5小時,至溴酚藍移出2/36．觀察: (戴手套)紫外燈下（254-365nm）, 暗處觀察, 記錄。可見DNA橙紅色區帶

【注意事項】

1．在EP管加入試劑時要用漩渦混合器混合后離心。

2．瓊脂糖凝膠電泳時加樣側應位于負極端。

3．溴乙錠可引起基因突變，操作時要注意個人防護。

4．紫外光對人眼有害，觀察時加蓋玻璃罩，觀察時間不宜太長。

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