流式細(xì)胞儀原理及及其在植物上的應(yīng)用和選用
摘要：隨著科技水平的不斷深入，科研設(shè)備的不斷更新，國家對(duì)科研投入的不斷增多，植物檢測(cè)技術(shù)也得到了進(jìn)一步的發(fā)展。流式細(xì)胞儀植物檢測(cè)技術(shù)是近幾年在我國剛剛興起的一項(xiàng)新技術(shù)，對(duì)許多植物科技工作者來說還比較陌生。本文用比較通俗的語言介紹了進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析所必須的基本概念、發(fā)展歷史、工作原理、知名品牌、常見型號(hào)及其在植物上的應(yīng)用。
關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞儀；植物；檢測(cè)技術(shù)
Flow Cytometry
Zhao Hong (Beijing Vegetable Research Center，Bering 100089，China)
Abstract：With the development of science，with the updating of scientific equipments，and with the increasing investment by nation，the plant measurement technologies have been made great progress．Flow cytometry(FCM)is a new technology appeared recently in China．It is still strange to many plant scientific researchers．In this article we briefly introduce the bas―ic concept and history of FCM，simply explmn the principle，concretely present three famous companies and their modelTl models，and demonstrate some applications of FCM in plants science．
Key words：Flow cytometry ；plant；measurement
1 流式細(xì)胞儀的概念及其發(fā)展歷史
1．1 流式細(xì)胞儀的基本概念流式細(xì)胞儀(flow cytonletry，F(xiàn)CM)是對(duì)高速直線流動(dòng)的細(xì)胞或生物微粒進(jìn)行快速定量測(cè)定和分析的儀器，主要包括樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分選技術(shù)，計(jì)算機(jī)對(duì)數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。
流式細(xì)胞儀以流式細(xì)胞術(shù)為理論基礎(chǔ)，是流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程學(xué)、分子免疫學(xué)、細(xì)胞熒光化學(xué)和計(jì)算機(jī)等學(xué)科知識(shí)綜合運(yùn)用的結(jié)晶。流式細(xì)胞術(shù)是一種自動(dòng)分析和分選細(xì)胞或亞細(xì)胞的技術(shù)。其特點(diǎn)是：測(cè)量速度快、被測(cè)群體大、可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，即對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、生物化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有效。
1．2 流式細(xì)胞儀的發(fā)展簡(jiǎn)史最早的流式細(xì)胞儀雛形誕生于1934年，Moldavan提出使懸浮的單個(gè)血紅細(xì)胞流過玻璃毛細(xì)管，在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用光電記錄裝置測(cè)量的設(shè)想。1953年Crosland ―Taylor根據(jù)牛頓流體在圓形管中流動(dòng)規(guī)律設(shè)計(jì)了流動(dòng)室。
其后又經(jīng)過Coulter Parker Horst Kamentsky1 Gohde、Fulwyler Herzen―berg等人的不斷改進(jìn)，設(shè)計(jì)了光電檢測(cè)設(shè)備和細(xì)胞分選裝置、完成了計(jì)算機(jī)與流式細(xì)胞儀的物理連接及多參數(shù)數(shù)據(jù)的記錄和分析、開創(chuàng)了細(xì)胞的免疫熒光染色及檢測(cè)技術(shù)、推廣流式細(xì)胞儀在臨床上的應(yīng)用?。
近20年來，隨著流式細(xì)胞儀及其檢測(cè)技術(shù)和的13臻完善，人們?cè)絹碓街铝τ跇悠分苽洹⒓?xì)胞標(biāo)記、軟件開發(fā)等方面的工作，以擴(kuò)大FCM的應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。
宋平根的《流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用》是迄今為止對(duì)流式細(xì)胞儀及其技術(shù)闡述的最為詳盡和透徹的中文著作。這本書非常詳細(xì)地介紹了流式細(xì)胞術(shù)的歷史、結(jié)構(gòu)、原理、技術(shù)指標(biāo)等，例舉了其在醫(yī)學(xué)和生物工程中的應(yīng)用，非常適合從事此方面專業(yè)研究的人。
由于這本書是13年前出版的，所以基本上沒有涉及植物流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)。此外對(duì)于只需要對(duì)流式細(xì)胞儀有些基本認(rèn)識(shí)的人士來說，這本書太復(fù)雜太深?yuàn)W。謝小梅 主要介紹了流式細(xì)胞儀在生物工程中的應(yīng)用。楊蕊概括了流式細(xì)胞儀的工作原理，簡(jiǎn)單提及了流式細(xì)胞儀的應(yīng)用。
本文在分析這三篇論著或文章的優(yōu)缺點(diǎn)后，用比較通俗的語言介紹了掌握流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)必須了解的一些原理，并對(duì)目前市場(chǎng)上的主流型號(hào)進(jìn)行了客觀的性能概括。
2 流式細(xì)胞儀的工作原理和技術(shù)指標(biāo)
2．1 流式細(xì)胞儀工作原理 除電源外，流式細(xì)胞儀主要由四部分組成：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)：激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測(cè)系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)，其中流動(dòng)室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信號(hào)的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸?shù)娜蝿?wù)。
2．1．1 信號(hào)的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸在壓力作用下，鞘液管中的鞘液被持續(xù)不斷地壓入流動(dòng)室，形成一股穩(wěn)定地連續(xù)的液流，保證了樣本液穩(wěn)定地處于鞘液液流的軸線上，并以單個(gè)細(xì)胞形式直線通過激光照射區(qū)。激光照射區(qū)又稱測(cè)量區(qū)，是指液流與激光束垂直相交的點(diǎn)。
當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物通過激光照射區(qū)時(shí)，產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)部不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號(hào)，這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360。立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)，因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)或固有參數(shù)。
散射光又包括前向角散射和測(cè)向角散射。前向角散射與被測(cè)細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)，測(cè)向角散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。
熒光信號(hào)也有二種；一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出的微弱熒光信號(hào)，另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記后的細(xì)胞受激發(fā)照射后得到的熒光信號(hào)。在免疫分析中常要同時(shí)探測(cè)兩種以上波長的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。
經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受到適合的光激發(fā)后產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量的。最常用的光電轉(zhuǎn)換器是光電倍增管(PMT)。從PMT輸出的電信號(hào)需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。流式細(xì)胞儀中一般備有兩類放大器。
一類是線性放大器，其輸出信號(hào)與輸入信號(hào)成線性關(guān)系。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物學(xué)線性過程的信號(hào)，如DNA測(cè)量等。
另一類是對(duì)數(shù)放大器，其輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成常用對(duì)數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測(cè)量中常使用對(duì)數(shù)放大器。
放大后的電信號(hào)被傳送到計(jì)算機(jī)，再經(jīng)模一數(shù)轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿C(jī)處理器形成數(shù)據(jù)文件，保存在計(jì)算機(jī)上。保存在計(jì)算機(jī)上的數(shù)據(jù)可在脫機(jī)后再進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
2．1．2 流式細(xì)胞儀分選原理并不是所有的流式細(xì)胞儀都具有分選功能。流式細(xì)胞儀的分選功能是由細(xì)胞分選器來完成的。由噴嘴射出的液流柱在電信號(hào)作用下發(fā)生振動(dòng)，斷裂形成均勻的小液滴。
根據(jù)選定的某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過靜電場(chǎng)而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中。使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會(huì)改變分選效果。
從參數(shù)測(cè)定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時(shí)間。精確測(cè)定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，可根據(jù)具體要求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。 2．1．3 數(shù)據(jù)的顯示和分析數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析。單參數(shù)直方圖是使用最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。
單參數(shù)直方圖是由x、Y二方向組成的二維平面圖。橫座標(biāo)x是所測(cè)的熒光或散射光的強(qiáng)度，用“道數(shù)”(Channel No．)來表示。選擇的放大器類型不同，標(biāo)度不同。縱座標(biāo)Y通常表示被測(cè)細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目。正常情況下，數(shù)據(jù)分析得到的圖形為具有一個(gè)或若干個(gè)峰的曲線圖。對(duì)曲線圖的解釋應(yīng)該具體問題具體分析。
除直方圖外，數(shù)據(jù)顯示方式還包括二維點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。二維點(diǎn)圖也是比較常用的數(shù)據(jù)顯示類型。它顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系，也是二維平面圖，橫縱坐標(biāo)可以根據(jù)自己選定的被測(cè)參數(shù)自行決定，點(diǎn)的位置表明了細(xì)胞和顆粒具有的二個(gè)被測(cè)參數(shù)的數(shù)值。二維點(diǎn)圖所提供的信息量要大于單參數(shù)直方圖。
數(shù)據(jù)分析的方法大體可分為參數(shù)法和非參數(shù)法兩大類。當(dāng)被檢測(cè)的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型時(shí)則多使用參數(shù)方法。非參數(shù)分析法不用對(duì)顯示的圖像做任何假設(shè)，也不采用數(shù)學(xué)模型，分析程序可以很簡(jiǎn)單．也可能很復(fù)雜。臨床醫(yī)學(xué)較常使用非參數(shù)分析法。
2．2 流式細(xì)胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)流式細(xì)胞儀性能的技術(shù)指標(biāo)主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指分辨兩個(gè)相鄰峰的最小距離，通常用變異系數(shù)(CV值)來表示。現(xiàn)在市場(chǎng)上主流型號(hào)出廠時(shí)的熒光分辨率應(yīng)該小于2.0％。
熒光靈敏度反映了儀器探測(cè)最小熒光光強(qiáng)的能力。一般用熒光微球上可測(cè)出的FITC的最少分子數(shù)來表示。目前儀器均可達(dá)到1000左右。儀器工作時(shí)樣品濃度一般在105―107細(xì)胞／m1。分析速度／分選速度是指流式細(xì)胞儀每秒種可分析或分選的顆粒數(shù)目。一般分析速度為5000―10000，分選速度控制在1000以下。
流式細(xì)胞儀測(cè)量的數(shù)據(jù)是相對(duì)值，因此需要在使用前對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定。流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)有二個(gè)目的，即儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。通常使用標(biāo)準(zhǔn)微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。
3 主流流式細(xì)胞儀型號(hào)及其特性介紹
目前擁有市場(chǎng)較大份額的公司是美國的BD(Becton― Dickinson)公司、Beckman―Coulter公司(原名稱Cou1．ter)和德國的Partec公司。
3．1 BD公司流式細(xì)胞儀介紹BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀都冠以FACs(fluorescence activated cell sorter)，即熒光激活細(xì)胞分選器。其型號(hào)種類比較齊全，如早期的FAC．Sort、FACS Canto、FACSean，。現(xiàn)在市場(chǎng)上供應(yīng)的型號(hào)有五種：FACSCount(小型流式細(xì)胞儀)、FACSCAlibur(流式細(xì)胞儀)、FACSAfia(流式細(xì)胞分選儀)、FACSVantage SE(多色分析和高速分選流式細(xì)胞儀)、LSRII(數(shù)字化分析型流式細(xì)胞儀)。
FACSCount為精確計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞CD3，CD4，CD8絕對(duì)數(shù)而設(shè)計(jì)的。FACSCalibur是全自動(dòng)多色流式系統(tǒng)，偏重于臨床，其整體設(shè)計(jì)幫助臨床醫(yī)生快速實(shí)現(xiàn)常規(guī)免疫表型、CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)、DNA、網(wǎng)織紅細(xì)胞、血小板等臨床分析，兼具分選功能。配備有二根激光管，可同時(shí)檢測(cè)4個(gè)熒光參數(shù)。可識(shí)別粘聯(lián)細(xì)胞
BD FACSAfia流式細(xì)胞分選儀為臺(tái)式高速細(xì)胞分選儀，獲取速度達(dá)70，000細(xì)胞/s，分析速度達(dá)50，000細(xì)s。使用石英杯流動(dòng)檢測(cè)池固定光路校準(zhǔn)技術(shù)。使用三種激光，多色分析，分析參數(shù)可達(dá)15色。兩管或四管分選，可以使用多種規(guī)格的收集管。
液流監(jiān)測(cè)系統(tǒng)白動(dòng)監(jiān)測(cè)液流斷點(diǎn)，檢查堵塞，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞分選的無人操作。配件BDACDU裝置，可以在微孔板或載波片上定量分選細(xì)胞。FACSVantage SETM是在FACSVantage的細(xì)胞分選功能基礎(chǔ)上推出的分選增強(qiáng)型流式細(xì)胞儀。六色熒光分析系統(tǒng)，點(diǎn)對(duì)點(diǎn)分選，配置FACS Diva數(shù)字化系統(tǒng)，提供全面的配套試劑。速度和功能優(yōu)于FACSVantage。
BD LSR II是LSR的數(shù)字化升級(jí)版，其性能介于FACSVantage SE和FACS Calibur之間，是專為生命科學(xué)研究設(shè)計(jì)的臺(tái)式機(jī)。配備固定校準(zhǔn)的紫外激光，四種激光立體空間激發(fā)、十色熒光同時(shí)分析、電子系統(tǒng)數(shù)字化、比較易學(xué)易用。
3．2 Beckman―Coulter公司流式細(xì)胞儀介紹 Beckman― Coulter公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀以Profile(早期，現(xiàn)已停產(chǎn))和EPICS系列為代表，近年又推出了Cytomics FC500系列。
EPICS系列是大型流式細(xì)胞儀，目前市場(chǎng)上有XL、XL―MCL和ALTRA三種型號(hào)，其中ALTRA具有分選功能，適用于免疫學(xué)、細(xì)胞生理、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、水質(zhì)分析和植物細(xì)胞分析。
Cytomics FC500系列流式細(xì)胞儀體積小，可自動(dòng)進(jìn)行5種顏色的分析，適用于免疫學(xué)檢測(cè)，如人類HIV診斷。特別是FC50OMPL的獨(dú)特設(shè)計(jì)可以在同一系統(tǒng)上使用12×75mm的離心管和24或96孑L的平板。特別適合工作量大的實(shí)驗(yàn)室。
這二個(gè)公司主要針對(duì)醫(yī)學(xué)研究和臨床工作進(jìn)行設(shè)計(jì)和生產(chǎn)，其產(chǎn)品可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究以及臨床檢測(cè)的許多領(lǐng)域，如遺傳、腫瘤、血液、免疫等諸多研究中紅細(xì)胞、T細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定、檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞免疫測(cè)定等。這二個(gè)公司的流式細(xì)胞儀價(jià)格昂貴，我國主要購買、使用的單位基本上都是一些醫(yī)療機(jī)構(gòu)。
3．3 Partee公司流式細(xì)胞儀介紹 與BD和Becman―Coutler公司的產(chǎn)品相比，德國Partee公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀的共同特點(diǎn)是體積小，造價(jià)低，易操作，便于攜帶，適合植物學(xué)研究，適合邊遠(yuǎn)地區(qū)和發(fā)展中國家。
德國Partec公司的產(chǎn)品分為三類：CCA家族、PAS家族和CyFlow家族(Galaxy為早期產(chǎn)品，已停產(chǎn))。CCA家族包括細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀CCA和倍性分析儀PA―I。
它是單或雙參數(shù)的臺(tái)式小型機(jī)，可以進(jìn)行一些常規(guī)分析，如核DNA測(cè)定(檢測(cè)倍性或細(xì)胞周期)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞凋亡。它的特點(diǎn)是體積小，易操作，價(jià)格低，檢測(cè)范圍廣，可以檢測(cè)多種熒光素(如PI、DAPI、Fluorescein)發(fā)出的熒光。
PAS家族包括粒子分析系統(tǒng)PAS、粒子分析系統(tǒng)III(PAS―III)和倍性分析儀PA―II。提供三種激光器的三種組合，可檢測(cè)十余種熒光染料。最多可檢測(cè)和記錄八個(gè)獨(dú)立熒光參數(shù)。
倍性分析儀PA能夠在2分鐘內(nèi)自動(dòng)測(cè)量植物的倍性水平，檢測(cè)異倍體。可以對(duì)葉片、幼苗、種子、果皮、根、花等植物材料進(jìn)行分析。在大多數(shù)植物中，異倍體染色體的檢測(cè)分辨率為±1條染色體。PA―I使用HBO一100汞燈，屬于弧光燈，可產(chǎn)生紫外激發(fā)光和藍(lán)光。
PA―II中增加了488 am氬離子激光器，能夠檢測(cè)幾乎所有的熒光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，F(xiàn)ITC，F(xiàn)DA等。汞燈發(fā)光是電流經(jīng)過氣體時(shí)，氣體電離產(chǎn)生的。它能提供最佳的激發(fā)波長。
CyFlow(R)SL配備三種激光管，可應(yīng)用于諸如人類健康、微生物學(xué)、工業(yè)應(yīng)用、過程控制、生態(tài)學(xué)等研究。如HIV掃描中免疫標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)、食品處理過程中的微生物計(jì)數(shù)、細(xì)胞凋亡等。它使用l2 V直流電，特別適合邊遠(yuǎn)地區(qū)和發(fā)展中國家。
國際上20世紀(jì)80年代開始將流式細(xì)胞儀檢測(cè)應(yīng)用到植物的研究中(Galbraith ，1983)，眾多學(xué)者都認(rèn)為流式細(xì)胞儀是一種準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)DNA含量的方法(Michae|son ，1991)。
應(yīng)用范圍主要是利用流式細(xì)胞儀研究屬內(nèi)、屬間多種植物的DNA含量(Baird ]，1994；Ja―cob[，1996；HALL ，2000)和倍性水平(Costich ，1993；Meng[101，2002)、檢測(cè)體細(xì)胞雜種(Pfosser? ，1995；Kel―ler[”，1996)和游離小孢子培養(yǎng)再生株(Kim¨3 ，2003)的DNA含量。過去我國應(yīng)用這一檢測(cè)技術(shù)的植物研究工作者寥寥無幾，且大多是在國外實(shí)驗(yàn)室完成的。
研究?jī)?nèi)容包括植物生理Ⅲ 引、程序性死亡Ⅲ 、倍性鑒定mI2 等。植物研究中使用的流式細(xì)胞儀基本上都是Partec公司的產(chǎn)品，也有少量是BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀。BD公司的產(chǎn)品主要定位于醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用，與Partec產(chǎn)品相比，不太適合從事植物染色體倍性的鑒定。
主要體現(xiàn)在不能提供植物樣品制備技術(shù)／試劑，數(shù)據(jù)獲取軟件可同時(shí)檢測(cè)到的倍性數(shù)目少。
