體外肝細胞損傷模型建立（CCl4和H2O2）

1　大鼠肝細胞的分離和培養　大鼠4％戊巴比妥麻醉，門靜脈插管，先以無鈣灌流液灌流，繼以37℃通入O2的Ⅳ型膠原酶灌流液繼續循環灌流15 min。將肝臟移至一平皿內，輕輕撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成單個肝細胞懸液，200目尼龍網過濾，低速離心（500 r?min-1，1 min，4℃）棄上清，同法用清洗液反復洗3次。然后用完全1640培養液（內含10％小牛血清，105　U?L-1青霉素，100 mg?L-1鏈霉素和10 mg?L-1胰島素）制成1×109個?L-1肝細胞懸液。分離的肝細胞經0.6％臺盼藍拒染法測得細胞活力大于90％，高碘酸雪夫反應顯示糖原法鑒定99％為肝實質細胞。

　　將上述肝細胞懸液分別加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培養板中，置37℃，5％CO2培養箱中培養。12～16 h后可見肝細胞貼壁于培養板孔底上生長。

　2　CCl4誘導肝細胞壞死性損傷模型的建立　肝細胞培養12 h后，吸棄上清，更換培養液并加入不同濃度的CCl4〔（1～16　mmol?L-1），以少量的二甲亞砜助溶，二甲亞砜終濃度為0.1％（體積分數）〕，作用不同時間（1～12 h）后，收集24孔板中培養上清檢測AST，以及肝細胞的MDA含量和GSHpx活性；同步測定96孔板中培養肝細胞的MTT反應。根據檢測結果制備CCl4誘導肝細胞損傷的量效和時效曲線。選擇最造損傷濃度和損傷時間制備肝細胞的損傷模型，同時設溶媒對照組，每組至少設3個復孔。

　3　H2O2誘導肝細胞壞死性損傷模型的建立　同法更換培養液，加入不同濃度的H2O2（0.2～3.2 mmol?L-1），作用不同時間（0.5～4 h）后，收集24孔板中培養上清檢測ALT，測定肝細胞的MDA含量；同步測定96孔板中培養肝細胞的MTT反應。根據檢測結果制備H2O2誘導肝細胞損傷的量效和時效曲線，選擇最適損傷濃度和損傷時間制備肝細胞的損傷模型，同時設溶媒對照組，每組至少設3個復孔。

　4　檢測指標

1  AST、ALT的測定　培養的肝細胞經離心（1 800 r?min-1，10 min）后收集上清，按試劑盒說明書步驟測定上清液中AST和(或)ALT活性，結果以U?(106 cell)-1表示。
2  肝細胞增殖試驗　采用MTT比色法。

3  肝細胞谷胱甘肽過氧化物酶（GSHpx）活性的測定　先制備GSH標準曲線。棄肝細胞培養上清，加入0.2％ Triton-100水溶液0.5 ml，混勻，2 min后，離心（2 500 r?min-1，10 min），取上清液（肝細胞樣品）0.4 ml，另設樣品空白管，非酶反應管和試劑空白管，加入各種試劑。混勻后立即計時，靜置12 min后，以樣品空白管調零點，于423 nm波長處讀得吸光度（A）值。在GSH標準曲線上查出對應的GSH波度。GSHpx酶活力單位是在37℃，pH6.5條件下，每106個肝細胞、每分鐘使GSH濃度下降1 μmol為1個酶活力單位。計算公式為：GSHpx活力單位=（［GSH］非酶管-［GSH］樣品管-［GSH］試劑空白管）/3。結果以U?(106 cell)-1表示。

4  肝細胞丙二醛（MDA）含量的測定　先制備MDA標準曲線。棄肝細胞培養上清，加入生理鹽水1 ml，混勻，移入離心管中，離心（2 500 r?min-1，10 min），棄上清，加15％ TCA 2 ml，破壞細胞并沉淀蛋白質，加入0.67％ TBA 2 ml，于沸水浴中加熱30 min。根據樣本的吸光度值在標準曲線上查出對應的濃度，結果以 nmol?(106 cell)-1表示。

5  數據處理　數據以±s表示，計量資料組間比較采用t檢驗。兩變量間相互關系，采用直線相關和回歸分析。