解析植物乳植桿菌ST的功能基因組
近日，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)和云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院對L.plantarumST及NCBI已公開的152株L.plantarum全基因組序列和1株模式菌株ATCC14197T基因組序列進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，從基因組水平全面分析該菌株的功能基因，同時(shí)利用API50CHL測定該菌株的碳水化合物利用情況，旨在為使其成為功能性食品的生產(chǎn)菌株或微生態(tài)制劑奠定理論基礎(chǔ)。
1 ANI分析與泛-核心基因構(gòu)建
ANI是通過比對基因組的同源序列以鑒定菌株親緣關(guān)系。在比較基因組學(xué)分析過程中通常認(rèn)為ANI值大于95%為同一物種，ANI可用于判斷基因組間的相似性及評估基因組間多態(tài)性程度。本研究對154株L.plantarum菌株進(jìn)行ANI計(jì)算，并構(gòu)建聚類熱圖。結(jié)果表明，全部菌株之間ANI值均大于98%，表明研究所用菌株均為同一物種即L.plantarum。其中，L.plantarumST和模式菌株L.plantarum ATCC 14917T的ANI為99.05%。
154株L.plantarum的泛基因集包括了17378個(gè)基因，其中核心基因1262個(gè)，特有基因6427個(gè)。由實(shí)驗(yàn)可知，隨基因組數(shù)量的增加，泛基因個(gè)數(shù)依然表現(xiàn)出增加趨勢，而核心基因個(gè)數(shù)逐漸趨于穩(wěn)定。這一現(xiàn)象符合開放式基因組的特點(diǎn)，所以推測L.plantarum為開放式基因組。
2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析
為研究L.plantarum ST與其余153株L.plantarum種內(nèi)遺傳進(jìn)化關(guān)系，采用NJ法，以Roary軟件識別得到的1262個(gè)核心基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為1000。154株L.plantarum中包括76株蔬菜與谷物分離源、14株乳制品分離源、10株肉制品分離源、22株腸道分離源、4株果蠅分離源及28株其他分離源。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，154株L.plantarum在進(jìn)化過程中由于遺傳多樣性使其被分為兩大分支，集中在1個(gè)分支說明親緣關(guān)系更接近。ST處于第II分支中的單獨(dú)一小分支，與腸道分離株BCC9546遺傳距離較近。從系統(tǒng)發(fā)育樹中分支中選取幾株代表性、已有相關(guān)益生特性研究報(bào)道的菌株，作為對照，與L.plantarum ST繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的比較基因組學(xué)分析。選取菌株為：JDM1、LIP-1、P8、ZJ316、ZS2058、WCSF1、ST-III、ATCC14197T、KP。
3 RAST注釋結(jié)果
10 株L.plantarum共注釋到25 個(gè)功能大類。10株L.plantarum中參與碳水化合物代謝的基因數(shù)量最多（21.6%），其次是氨基酸及其衍生物合成與降解（14.62%）和蛋白質(zhì)代謝（11.87%）相關(guān)基因，其中氮代謝（0.21%）相關(guān)功能編碼基因僅在菌株JDM1、WCFS1、ZS2058中存在。L.plantarum ST注釋到24個(gè)功能類別。
注釋結(jié)果表明這些L.plantarum參與碳水化合物代謝的基因數(shù)量最多。碳水化合物代謝能力與基因組中存在多種編碼、運(yùn)輸糖代謝的基因及相應(yīng)的調(diào)控蛋白有關(guān)。因?yàn)長.plantarum可以廣泛利用多種糖源，所以可以應(yīng)對更多復(fù)雜的環(huán)境。很多磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)存在于L.plantarum中，為機(jī)體輸送糖類物質(zhì)是該系統(tǒng)的作用。RAST注釋結(jié)果顯示W(wǎng)CFS1中共注釋到57個(gè)PTS相關(guān)功能基因，ST共注釋到49個(gè)。已有研究報(bào)道，L.plantarum WCFS1株包括完整的PTS酶II復(fù)合物以及運(yùn)輸系統(tǒng)，與WCFS1相比，本研究發(fā)現(xiàn)ST也有相同的糖類物質(zhì)運(yùn)送系統(tǒng)，從而確保菌株對糖的利用。
4 KEGG注釋結(jié)果
10株L.plantarum 在KEGG數(shù)據(jù)庫中分別在新陳代謝、細(xì)胞過程、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、生物系統(tǒng)和人類疾病6大功能37個(gè)通路上得到功能注釋，分析發(fā)現(xiàn)所有菌株的基因功能注釋主要分布于代謝通路中，碳水化合物代謝是11個(gè)代謝通路中基因數(shù)量最多的，共2008個(gè)基因占代謝通路注釋基因的23.2%。氨基酸代謝次之。環(huán)境信息處理中最多注釋的是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜運(yùn)輸，其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要集中于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。多種糖類的代謝通路包含在碳水化合物代謝通路中，L.plantarum ST中碳水化合物代謝多達(dá)200個(gè)基因注釋量，推測L.plantarum ST可能有較強(qiáng)的糖類分解及代謝功能，為機(jī)體提供能量。
可調(diào)控免疫和炎癥的通路相關(guān)基因，包括過氧化物酶體增生物激活受體（PPAR）和維甲酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）通路。其中，STGL000154、STGL002738參與PPAR信號通路的調(diào)控，PPAR通路與細(xì)胞分化、炎性反應(yīng)和能量代謝等緊密相連。在RIG-I樣受體信號通路的調(diào)控中基因STGL000333參與，RIG-I樣受體是固有免疫的模式識別受體，這個(gè)受體可以辨別非自身的病毒RNA，通過激活該受體信號通路最終達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞因子生成的目的，從而發(fā)揮出抗病毒的功效，這可能是L.plantarum具有抗病毒作用的因素。推測L.plantarumST能夠幫助宿主抵抗病原菌的侵襲、進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡。
5 CAZy注釋結(jié)果
為了從基因組層面探究L.plantarum ST對碳水化合物的利用能力，利用CAZy數(shù)據(jù)庫分析了10株L.plantarum的CAZy功能基因。5種CAZy類在這10株L.plantarum中被注釋到，分別為碳水化合物碳結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBMs）、糖苷水解酶類（GHs）、輔模塊酶類（AAs）、糖苷轉(zhuǎn)移酶類（GTs）、碳水化合物酯酶類（CEs）。10株L.plantarum共注釋到47個(gè)CAZy基因家族，包括24個(gè)GHs家族、12個(gè)GTs家族、4個(gè)CEs家族、4個(gè)CBMs家族和3個(gè)AAs家族。
ST及另外9株菌注釋到的GHs、GTs含量最為豐富，無顯著差異。GHs可水解或重排糖苷鍵，將多糖水解為單糖，給予菌體能量。GTs催化糖基與其他糖類或非糖物質(zhì)的基團(tuán)進(jìn)行轉(zhuǎn)移，負(fù)責(zé)糖苷鍵的形成。其中，GT4在L.plantarum中拷貝數(shù)最多（平均約13個(gè)），其次是GT2（平均約11個(gè)）和GH1（平均約10個(gè)）。本研究10株L.plantarum注釋到了24個(gè)GHs，含量豐富。ST的GH家族中含量最多的是GH1、GH13_31，還包括GH170、GH25、GH65、GH73、GH78、GH36等。在纖維素降解的過程中糖苷水解酶類中一些酶類有水解作用，利用關(guān)鍵限速酶β-葡萄糖苷酶能把纖維二糖在內(nèi)的纖維寡糖分解為單糖，故推測L.plantarum ST具有良好的降解纖維素潛力。由圖可知注釋到CBM32、CBM34、CBM48，其中CBM48主要來自糖苷水解酶，多為普魯蘭酶、異淀粉酶、分支酶等。CBM的多樣性使其在底物特異識別、促進(jìn)酶與底物結(jié)合及酶穩(wěn)定性等方面均有重要作用。通過碳水化合物注釋結(jié)果推測L.plantarum ST有著較強(qiáng)的水解或重排糖苷鍵能力，同時(shí)可能具有良好的降解纖維素潛力。良好糖苷水解能力為L.plantarum ST用于益生菌制品奠定了基礎(chǔ)。
6 毒力和耐藥基因檢索分析
將L.plantarumST與其他9株L.plantarum的基因組經(jīng)毒力因子、耐藥基因數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)均不存在毒力因子和耐藥基因，故認(rèn)為L.plantarum ST是安全的，并且沒有潛在的耐藥性。
7 特有基因和益生基因分析
為進(jìn)一步挖掘L.plantarum ST功能基因同時(shí)解析其潛在的益生功能基因，繼續(xù)對菌株的特有基因和益生基因進(jìn)行分析。L.plantarum ST存在41個(gè)特有基因，除去一些假定蛋白編碼基因后，L.plantarum ST有3個(gè)特有功能基因，表2為特有功能基因信息，分別為乙二醛還原酶基因（yvgN）、酪氨酸重組酶基因（xerC）、能量耦合因子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（ecfT）。yvgN是一種加氫酶，對乙二醛進(jìn)行加氫反應(yīng)。ecfT是一種轉(zhuǎn)運(yùn)酶，負(fù)責(zé)攝入一些維生素及其他微量元素。
基于前期對L.plantarum ST益生功能的研究，使用Prokka軟件注釋到L.plantarum ST含有與益生特性相關(guān)的基因，具體信息見表3。群體感應(yīng)AI-2信號分子合成的最關(guān)鍵蛋白酶是S-核糖同型半胱氨酸裂解酶（LuxS），AI-2在微生物種內(nèi)和種間交流起到重要作用，在L.plantarum ST中發(fā)現(xiàn)了該基因。目前發(fā)現(xiàn)在超過80種細(xì)菌中均存在LuxS基因，細(xì)菌許多生理現(xiàn)象離不開LuxS介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)，因?yàn)檫@種系統(tǒng)對細(xì)菌有重要的調(diào)節(jié)作用。L.plantarum ST還含有谷胱甘肽合成（garB、gshAB）、核黃素合成（ribBA、ribE、ribF）相關(guān)基因，核黃素（VB2），作為輔酶有助于代謝是其主要功能。NAPPH還原酶類（nfrA），參與脂肪酸、核苷酸和脂類的合成等多種合成代謝反應(yīng)，該物質(zhì)起到遞氫體的作用在生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)中。
L.plantarum ST還注釋到了黏附因子（atpC）基因，黏附因子有助于細(xì)菌在宿主體內(nèi)的定植因?yàn)榭墒咕昀喂甜じ接谒拗骷?xì)胞表面。研究還發(fā)現(xiàn)，L.plantarum ST存在提高宿主代謝能力（tagE）、乳酸和轉(zhuǎn)運(yùn)乳酸（pyk、ldh）、細(xì)胞壁特殊組分成分（ItaS）和生物活性肽（lmrA）產(chǎn)生相關(guān)的基因，可提高菌株益生功能。特有基因和益生基因分析發(fā)現(xiàn)，L.plantarum ST含有與黏附能力、信號分子傳遞和抗氧化能力等相關(guān)的益生功能基因。因此，本研究從基因組水平揭示L.plantarum ST具有益生特性相關(guān)基因，認(rèn)為其是1株具有潛在益生功能的菌株。
8 碳水化合物代謝特性
為了評估L.plantarum ST對不同碳源的利用能力，利用API?50?CHL碳水化合物鑒定試劑條對ST的碳水化合物代謝進(jìn)行研究，挖掘出可被ST利用的碳源，為碳水化合物代謝中的功能基因分析提供表型數(shù)據(jù)支持，同時(shí)為該菌株在之后的應(yīng)用提供借鑒。
API50 CHL碳水化合物鑒定試劑條所涉及的49種碳水化合物中，可被ST利用的共有28種，劃分為單糖類（9）、糖苷類和二糖類（12）、多糖類（1）、醇類（4）、鹽類（2）物質(zhì)五大類。單糖類包括：L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺；糖苷類和二糖類包括：熊果苷、水楊苷、苦杏仁苷、七葉靈、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-龍膽糖、D-松二糖；多糖類包括：D-松三糖；醇類包括：丙三醇、肌醇、甘露醇、山梨醇；鹽類包括：葡萄糖酸鉀、5-酮基葡萄糖酸鉀。糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L.plantarum ST可代謝不同種類豐富的碳源，包括9種單糖、12種糖苷和二糖、1種多糖及4種醇類和2種鹽類物質(zhì)，再次說明了ST具有較強(qiáng)的碳水化合物代謝能力。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)KEGG注釋以及CAZy分析吻合，利用基因組學(xué)和表型分析相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)L.plantarum ST擁有較好的產(chǎn)CAZy能力，具備豐富的碳水化合物利用能力，可為開發(fā)相關(guān)酶制劑提供一定的參考價(jià)值。
9 結(jié) 語
對L.plantarum ST結(jié)合NCBI已公開的152株L.plantarum全基因組序列和1株模式菌株ATCC14197T的基因組序列進(jìn)行比較基因組學(xué)分析。ANI分析鑒定ST為L.plantarum，系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)L.plantarum ST與腸道分離株BCC9546遺傳距離較近，乳、肉制品分離株因來源不同而存在差異，分別集中在第II分支的上半部分和下半部分，同時(shí)果蠅分離株有明顯聚集趨勢。RAST和KEGG功能注釋發(fā)現(xiàn)，L.plantarum ST參與碳水化合物代謝的基因數(shù)量最多，包含大量的PTS相關(guān)基因，還發(fā)現(xiàn)PPAR和RIG-1免疫調(diào)控通路相關(guān)基因。CAZy注釋發(fā)現(xiàn)，L.plantarum ST有較多水解或重排糖苷鍵的基因，可能具有良好的纖維素降解能力。毒力和耐藥注釋比對后發(fā)現(xiàn)ST不存在毒力因子和耐藥基因。特有基因分析發(fā)現(xiàn)，L.plantarum ST攜帶特有的與能量轉(zhuǎn)運(yùn)功能有關(guān)功能基因ecfT；益生特性基因顯示，L.plantarum ST具有與群體感應(yīng)信號分子AI-2（LuxS）、黏附分子（atpC）和谷胱甘肽（garB、gshAB）合成相關(guān)的功能基因。
API50CHL碳水化合物代謝結(jié)果顯示，L.plantarum ST可代謝單糖類、糖苷和二糖類及多糖類等中的29種碳源，ST能夠利用的碳源非常豐富。綜上，本研究從基因組水平分析了L.plantarum ST功能基因組特征，結(jié)合糖發(fā)酵表型結(jié)果，認(rèn)為L.plantarum ST是1株安全且具有潛在益生特性基因的益生菌，為后續(xù)L.plantarum ST益生功能開發(fā)及其生產(chǎn)應(yīng)用奠定了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。
