無血清培養基與完全培養基體外誘導擴增 CIK細胞
【摘要】 目的 比較無血清培養基（AIMV）與完全培養基（CM）體外誘導擴增CIK細胞及CIK細胞分泌細胞因子水平。方法 分別用AIMV及完全培養基加入4種細胞因子(IFNγ、IL2、IL1及OKT3)將臍帶血單個核細胞(CBMNCs)誘導成CIK細胞，比較細胞的增殖能力、細胞表型及分泌細胞因子水平。結果 與完全培養基比較，無血清培養基培養的CIK細胞增殖高峰較晚(14～17天),但增殖倍數高，在細胞表型、分泌細胞因子水平方面兩種培養基培養的CIK細胞均無明顯的差別（P＞0.05）。結論 無血清培養基可代替完全培養基。
【關鍵詞】 無血清培養基 免疫 細胞培養 細胞因子 腫瘤
0 引言
CIK細胞（Cytokineinduced killer，CIK）是將人外周血單個核細胞，在體外用多種細胞因子（如IFNγ、IL2、IL1及OKT3等）共同培養一段時間后獲得的一群異質細胞。具有極強的增殖能力及殺傷腫瘤細胞的能力。Critzapis等[1]報道，CIK細胞分泌多種細胞因子進一步提高免疫效應細胞的細胞毒作用從而殺傷腫瘤細胞。治療所需的CIK細胞在體外培養時所用的條件對細胞的活性有很大影響。現在常用于細胞培養的完全培養基,因含有人AB血清,雖經HBV、HCV及HIV的檢測,但仍有可能傳播其他疾病,安全性低;并且存在批次差異、不宜質控，質量不能保證。無血清培養基則可達到生物潔凈要求,成分明確,質量穩定,便于質控,克服了人ＡＢ血清的缺點,能減少病人意外感染的機會，對于免疫治療的推廣應用有重要意義。為此,我們比較了無血清培養基（ＡＩＭＶ）與完全培養基(含10%胎牛血清RPMI 1640)培養CIK細胞分泌細胞因子水平。
1 材料與方法
1.1 材料
健康足月產胎兒臍帶靜脈血50ml(枸櫞酸鈉抗凝),產婦各項生化指標檢測正常。RPMI1640培養基、淋巴細胞分離液和無血清培養基購自GIBCO公司,細胞因子購自Bioscience公司, 流式試劑CD45FITC/CD4PE/CD8ECD/CD3PC5、CD3FITC CD16+CD56PE和PI染液購自BeckmanColuter公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
臍血用淋巴細胞分離液作密度梯度2500r/min離心30min分離的外周血單個核細胞, 分別用完全培養基(RPMI 1640,含10%胎牛血清,100μｇ/ｍｌ鏈霉素,100Ｕ/ｍｌ青霉素)和無血清培養基調整細胞數為1×106個/ml,接種于24孔培養板,930μl/孔。第1天加入rhIFNγ 1 000u/ml,培養24h后加入rhIL2 300u/ml、rhIL1 100u/ml及OKT 350ng/ml繼續培養,每隔4d更換培養基,調細胞數為1×106個/ml,補加rhIL2 300u/ml,每8d在補加rhIL2的同時補加OKT 350ng/ml。YTMLC、GLC和A549用含10%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640常規培養。設不加細胞因子的CBMNCs培養作為對照。
1.2.2 細胞表型分析
于培養的第0、4、8、10、12、14、17、21d對以上各組效應細胞進行分析,每組每次測4個復孔。
1.2.3 細胞增殖能力測定
于培養的第0、4、8、10、12、14、17、21d分別取細胞用臺盼藍拒染法計數所培養的活細胞濃度,根據流式檢測的CIK的比例，計量液量,推算CIK細胞總數。
1.2.4 CIK細胞分泌IL2、IFNγ、TNFα細胞因子水平測定
于培養的第0、4、8、10、12、14、17、21d分別取細胞,充分洗滌,調整細胞濃度為2×106/ml培養24ｈ后,收集上清,用ＥＬＩＳＡ法定量測定細胞培養上清中IL2、IFNγ、TNFα，設4個平行孔。
2 結果
2.1 ＡＩＭＶ與完全培養基培養CIK細胞增殖能力的比較
實驗表明,ＡＩＭＶ培養細胞較完全培養基培養細胞增殖遲緩。完全培養基增殖高峰期在第12d，增殖平臺為第10～12d，最高增殖倍數為638.4倍；而ＡＩＭＶ培養基增殖高峰期在第14d，增殖平臺為第14～17d，最高增殖倍數為678.7倍。雖然ＡＩＭＶ培養細胞較完全培養基培養細胞增殖遲緩，但其增殖平臺期較長，增殖倍數較完全培養基高，見圖1。
圖1 AIMV與完全培養基培養CIK細胞增殖能力
2.2 ＡＩＭＶ與完全培養基培養細胞表型比較
實驗結果表明，兩種培養基培養的細胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+細胞所占百分比逐漸增多，CD3+CD56+細胞在ＡＩＭＶ培養基中，增長高峰在14～17d，所占相對百分率由（0.21±0.04）上升為（31.53±1.65）,增長了150.14倍，完全培養基增長高峰在12～14d，所占相對百分率由（0.21±0.04）上升為（30.90±2.28），增長了147.14倍。對照組CBMNCs培養體系中未出現明顯的細胞表型轉化,各種細胞成分均呈遞減趨勢，見表1、圖2。
2.3 AIMV與完全培養基培養的CIK細胞分泌細胞因子水平
2.3.1 IL2水平
AIMV與完全培養基培養的CIK細胞均分泌IL12，從第4d分泌量均穩定升高，都于12d達到高峰，第14d略有下降為，以后逐漸下降。但AIMV培養基第12d的IL2水平（222.525±19.889）pg/ml明顯高于完全培養基培養組（189.075±6.343）pg/ml，且下降水平也慢于CM組，見圖3。
A：培養前；B：完全培養基培養后；C：AIMV培養基后表1 ＡＩＭＶ與完全培養基培養細胞不同時間的表型變化
2.3.2 IFNγ水平
AIMV與完全培養基培養的CIK細胞均分泌IFNγ，在第4d IFNγ水平開始升高，第14～17d分泌量增大，完全培養基培養組第17d達到高峰為（246.854±4.758） pg/ml，而AIMV組14d達到高峰（227.88±3.048）pg/ml，高峰期后均迅速下降，見圖4。
2.3.3 TNFα水平
AIMV與完全培養基誘導培養的CIK細胞均分泌TNFα，第4～17dTNFα水平均平穩升高，完全培養基組第17d達到高峰為（247.032±9.117） pg/ml，第21d略有下降為（186.953±3.815）pg/ml，而AIMV組14d達到高峰為（222.53±8.965）pg/ml，之后TNFα水平開始下降，見圖5。
3 討論
CIK生物免疫治療已作為腫瘤綜合治療中的一種重要手段，能清除惡性腫瘤患者術后、放化療后微小殘留病灶及調節患者的免疫能力。但現在用于CIK擴增培養的培養基一般為AB血清培養基，但人ＡＢ血清存在安全性低,不宜質控等缺點,無血清培養基正得到越來越廣泛的應用。多數研究表明,無血清培養基可代替含血清的完全培養基,二者所得培養物的數目和功能相當[24];但也有不同的觀點,認為應用無血清培養基所得細胞功能受到損害[5,6]。無血清培養基ＡＩＭＶ是美國Ｇｉｂｃｏ公司專為體外培養淋巴細胞設計的產品,可用于臨床試驗。因為人ＡＢ血清存在個體差異、質量不穩定等諸多的不確定因素,因而我們選擇美國Ｇｉｂｃｏ公司的胎牛血清配制完全培養基作為標準對照,與無血清培養基ＡＩＭＶ作對比，探討無血清培養基代替完全培養基的可行性。
我們從細胞增殖能力、細胞表型分析及體外CIK細胞分泌的細胞因子等幾個方面進行比較。在細胞增殖能力方面，雖然ＡＩＭＶ培養基培養的CIK細胞較完全培養基培養細胞增殖遲緩，完全培養基增殖高峰期在第12天，增殖平臺為第10～12天，而ＡＩＭＶ培養基增殖高峰期在第14天，增殖平臺為第14～17天，但ＡＩＭＶ培養基培養的CIK細胞增殖平臺期較長，增殖倍數（678.7倍）較完全培養基（638.4倍）高。這說明無血清培養基支持細胞增殖能力的更為穩定可靠，也提示使用不同的培養基在回輸時間上應有所區別。在兩種培養基培養單個核細胞誘導增殖的過程中，各細胞表型雖在培養過程中有一定的差異，但在增殖高峰期無明顯差別。
CIK細胞具有較強的殺瘤活性，其作用可能與其在增殖過程中能分泌某些細胞因子有關，其主要效應細胞為CD3+CD56+細胞，并出現大量增殖，Lopez等[7]發現CD56+細胞能高表達IFNγ和TNFα，Hoyle等[8]用FACS檢測到CIK細胞能表達IL2、IFNγ及TNFα，這與我們的研究結果:CIK在體外誘導培養過程中能分泌IL2、IFNγ、TNFα一致。細胞因子在抗腫瘤的網絡調控機制非常復雜，IL2、IFNγ、TNFα在體內外抗腫瘤的過程起著重要的抗腫瘤及調節機體免疫功能的作用。分泌IL2，從第4天分泌量均穩定升高，都于12天達到高峰，以后逐漸下降。但AIMV培養基第12天的IL2水平（222.525±19.889）pg/ml明顯高于完全培養基組（189.075±6.343）pg/ml，下降水平也慢于CM組；IFNγ水平在第4天均開始升高，第14 ～17天分泌量增大，完全培養基組第17天達到高峰為（246.854±4.758） pg/ml，而AIMV組14天達到高峰（227.88±3.048）pg/ml；而TNFα，第4～17天TNFα水平均平穩升高，完全培養基組第17天達到高峰為（247.032±9.117） pg/ml，而AIMV組14天達到高峰為（222.53±8.965）pg/ml。可見，無論是AIMV培養基還是完全培養基其分泌細胞因子的趨勢是一致的，只是分泌IFNγ、TNFα水平AIMV培養基（14天）較全培養基（17天）早，但分泌水平無明顯差別（P>0.05）。AIMV培養基分泌細胞因子高峰與CIK效應細胞CD3+CD56+細胞增殖高峰一致（14天），因CIK細胞回輸時間最好應為在CIK細胞增殖高峰及細胞因子分泌高峰時，這有利于發揮其最佳療效，從這方面考慮，AIMV培養基優于全培養基。
我們的實驗表明，無血清培養基成分明確,來源穩定,功能可靠,易于質控，有利于保障患者治療的安全。可完全替代完全培養基，避免不必要的醫療糾紛，因而在生物治療中有巨大的優勢和廣闊的應用前景。
【參考文獻】
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