紅細胞膜的制備及其成份分析(磷脂、膽固醇)

一、紅細胞膜 的制備
(一)原理
隨著生物膜研究的迅速發(fā)展，在膜的結(jié)構(gòu)及功能的研究中分離和鑒定生物膜常常是必要的。為進行膜結(jié)構(gòu)的生物化學(xué)分析，必須首先分離出純凈的細胞膜。
哺乳動物的紅細胞膜在分離狀態(tài)下。一般稱為”血影”，其沒有通常真核生物細胞內(nèi)所含有的任何細胞器 ，經(jīng)過制備，容易得到純粹的細胞膜，并且在取材方面來源方便，因此哺乳動物的紅細胞膜是研究細胞膜的好材料。
從哺乳動物 紅細胞中分離細胞質(zhì)膜，第一步，將血液取放在加有抗凝劑的容器內(nèi)，用低速離心的方法從血液中分離出紅細胞，然后用等滲緩沖液重復(fù)洗滌多次，去除血漿。第二步，將洗凈的紅細胞從等滲緩沖液轉(zhuǎn)移到低滲緩沖液中，由于滲透壓力作用于細胞質(zhì)膜，使紅細胞膨脹而溶血。最后一步，將溶血的紅細胞經(jīng)過充分反復(fù)洗滌．高速離心，去除血紅蛋白和其他細胞內(nèi)含物。這樣制備所獲得的最終產(chǎn)品幾乎全是紅細胞膜。
(二)儀器、試驗材料和試劑
儀器
冷凍離心機、冰箱、自動移液管、相差顯微鏡、冷凍干燥機等。
原料
哺乳動物的血液
試劑
1. pH7.4等滲磷酸鹽緩沖液(含有0.15mol/L 氯化鈉的5mL，pH7.4磷酸鹽緩沖液)：
貯液A：稱取0.7808磷酸二氫鈉溶于水，定容至1000mL；
貯液B：稱取3.5828磷酸氫二鈉溶于水，定容至2000mL；
取380mL 貯液A 加1620mL 貯液B，用少量濃鹽酸調(diào)PH 至7.4．再稱取17.5g 氯化鈉加入其中。
2. pH7.4低滲tris 緩沖液(10mmol/LpH 7.4Tris-鹽酸緩沖液)：
貯液A：稱取2.42gTis，溶于水，稀釋至500mL；
貯液B：取0.84mL36％一38％鹽酸，稀釋至100mL；
取500mL 貯液A 加414mL 貯液B，用水稀釋至近于2000mL，用6mol/L 鹽酸調(diào)pH7.4，再定容到2000mL。
3. 肝素－PH7.4等滲磷酸鹽緩沖液：
將肝素溶于PH7.4低滲Tris 緩沖液中，使每毫升含肝素500單位。
(三)操作步驟
1.血液的收集及洗滌
將血液收集在含有抗凝劑的容器中，每30mL 血液加約5mL 肝素－pH7.4等滲磷酸鹽緩沖溶液。
為避免膜上含有的或膜上吸附的蛋白酶使膜蛋白發(fā)生變化，以下操作應(yīng)在－4℃低溫下進行。取30mL血液，于冷凍離心機(4℃)中3000r/min 離心20min，使紅細胞沉淀，用吸管吸盡血漿及沉淀的紅細胞表層的絨毛狀沉淀層，以避免其他類型細胞的混入。
將紅細胞置于3倍量預(yù)冷的pH7.4等滲磷酸鹽緩沖液中，用玻璃棒緩慢地攪拌懸浮，4℃5000r/min離心15min，除去上清液及沉淀表層，重復(fù)洗滌3次。
2.溶血和紅細胞膜的洗滌
在洗凈的紅細胞中，按照1:40的比例加入預(yù)冷的10mmol/LpH7.4低滲Tris(三羥甲基氨基甲烷)－HCl 緩沖液，邊加邊緩慢攪拌，置于4℃冰箱中1～2h，使之完成溶血。然后于4℃9000r/min 離心15min，使紅細胞膜沉淀。重復(fù)洗滌、離心3～5次，最后獲得白色的紅細胞膜樣品。
注意：

①溶血時低滲緩沖液的用量越大，紅細胞膜中血紅蛋白的殘留量越少，但體積大，離心費時間。因此，紅細胞與緩沖液的容量比例，以1:40為宜。

②膜的重量很輕，在溶血后離心傾倒上清液時容易流走，因此要特別小心，盡可能防止膜的損失。

③在制備過程中，若pH 值降低，殘留的血紅蛋白會迅速增加。當(dāng)pH 保持在7.4時，紅細胞膜中的血紅蛋白含量僅占總蛋白量的3~5％，相當(dāng)于血液中總血紅蛋白的0.1％。但pH 值降低至7.0時，血紅蛋白增加至20％。

④上述方法適用于大白鼠和人紅細胞膜的分離。牛、豬等紅細胞膜的制備，若反復(fù)進行低滲處理，將造成膜外表面包含具有乙酰膽堿酯酶活性的酯蛋白脫落，使膜容易破碎，得不到較完整的膜樣品。若在低滲緩沖液中加入1mmoL氯化鈣，即可完全防止這種膜的不穩(wěn)定性。
將最后一次離心所得到的紅細胞膜懸浮在2～4mLpH7.4等滲磷酸鹽緩沖液中。記錄懸浮液的總體積。注意，有時在膜的下面有少許未解體的紅細胞殘留物，不要將這部分殘留物懸浮在緩沖液中。