昆蟲細胞的低MOI桿病毒感染

感染懸浮細胞是使桿病毒系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白的普遍方法。懸浮培養(yǎng)的細胞很容易從 10ml 擴大到 100L 。一般來說，懸浮的細胞在無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。這種培養(yǎng)液許多公司有售，比如 Life Technologies 、 Hyclone 、 Biowhitaker 、 JRH Biosciences 、 Expression Systems 等，用起來都不錯，盡管由于細胞株和目的蛋白的不同，效果有所差異。

最好是將目的蛋白和細胞株用不同的培養(yǎng)液做一個表達試驗，選出表達效果最好的一種培養(yǎng)液。在進行這個表達試驗之前要先使你的細胞株分別適應(yīng)不同的培養(yǎng)液（見上文），否則試驗結(jié)果不具有代表性。

注意：為了優(yōu)化表達，你必須了解你的細胞的生長參數(shù)；為了方便新手，我將列出一些生長參數(shù)通常的值。我最喜歡的 Sf9 細胞株可以最低以 2 × 10⁵ 細胞 /ml 的濃度分裝，并且恢復(fù)幾乎沒有滯后期。在對數(shù)期， 20 個小時細胞數(shù)目就可以翻倍，濃度最高可以達到 5 × 10⁶ 細胞 /ml 。下面的實驗步驟將以上面列出的生長參數(shù)為前提。如果你的細胞株生長參數(shù)有所不同，你需要對實驗步驟做出合適的調(diào)整。

低 MOI 感染簡介

低 MOI （ Multiplicity Of Infection ，等于用于感染的病毒數(shù)目與細胞數(shù)目的比值）感染是擴增病毒的最好方法。這有兩個原因。一方面，低 MOI 感染是最快也是最簡單的擴增病毒數(shù)量的方法；另外，低 MOI 感染是保存病毒基因的完整性、防止 DIP （ Defective Interfering Particles ，即只包裝入部分基因組的病毒顆粒）生成的最好方法。

還可以用低 MOI 感染的方法生產(chǎn)蛋白，但是難以控制，并且不適于提高蛋白產(chǎn)量。然而病毒需要量少的確是該法的一個優(yōu)點，對于大規(guī)模的生產(chǎn)這個優(yōu)點極為有利，只要它們可以可靠的復(fù)制，這因不同的重組病毒而異。對于小規(guī)模的蛋白生產(chǎn)，我更喜歡用高 MOI 感染。

一般而言，低 MOI 感染的方法就是先用病毒感染少量細胞，這些被感染的細胞復(fù)制出足夠的病毒，去感染培養(yǎng)物中剩余的尚未被感染的細胞，而這第二批被感染的細胞就是病毒或者蛋白的主要生產(chǎn)者。

重要的是培養(yǎng)液的量要滿足細胞生長的需要，否則將沒有足夠的營養(yǎng)使細胞生產(chǎn)病毒或者蛋白。另一方面，病毒也不可以太多，以免在細胞增殖到合適密度并用掉所有營養(yǎng)資源之前就被殺死。最理想的是，先確定在沒有病毒感染時，細胞保持正常狀態(tài)所能達到的最大密度，那么如果病毒的量能夠使細胞在達到該密度的 1/3~2/3 時停止擴增是最理想的。我通常是使用該密度的 1/2 。

采用這個方法需要使用足夠的病毒感染細胞，在 24~48 小時內(nèi)使細胞停止增長、所有的細胞都被感染。因此，以生長停止作為完全感染的標(biāo)志，培養(yǎng)物在達到完全感染后可以繼續(xù)生長大約 48 小時。如果以生產(chǎn)蛋白為目的，這個過程可能需要更長。

步驟：

將細胞以 2~4 × 10⁵ 細胞 /ml 的密度分裝到搖瓶中，達到搖瓶體積的 20~40% 。在 27 ± 2 ℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為 100~130rpm 。

第 0 天

培養(yǎng)細胞至密度達到 4~8 × 10⁵ 細胞 /ml ，即已經(jīng)進入對數(shù)期生長，但是仍處于低濃度。

然后加入少量病毒，病毒量依賴于滴度，但是最好使 MOI 值介于 0.1~0.5 。比如，如果你的細胞濃度為 6 × 10⁵ 細胞 /ml ，而病毒滴度為 3 × 10⁷ pfu/ml ，那么要使 MOI 介于 0.1~0.5 ，所加的病毒的體積應(yīng)該是細胞體積的 0.2~1% 。

將搖瓶放回 27 ℃搖床，培養(yǎng) 24 小時。

感染后第 1 天

計數(shù)細胞，估計細胞大小。如果病毒的實際滴度比估計的高，即 MOI 值高于 0.5 ，你將看到明顯的細胞停止生長和腫脹的跡象；反之，如果 MOI 值接近 0.3 或者更低，你將看到細胞幾乎沒有受到病毒影響，它們的數(shù)目擴增到接近 1.2 × 10⁶ 細胞 /ml ，并且看起來健康。這個時候，被感染的細胞應(yīng)該正在釋放病毒至培養(yǎng)液中，去感染其它細胞。

感染后第 2 天

再次計數(shù)細胞并且估計細胞的大小。此時大多數(shù)細胞應(yīng)該已經(jīng)被感染。細胞的數(shù)目應(yīng)該遠遠低于 2.4 × 10⁶ 細胞 /ml （這是在沒有病毒感染的情況下細胞正常生長應(yīng)該達到的密度），并且明顯膨脹。

如果細胞的數(shù)目在感染后第 0 天和第 1 天之間沒有增長，可能是所有的細胞都被同時感染所致，在感染后第二天就可以收獲了。如果不是這種情況，將搖瓶放回 27 ℃搖床，培養(yǎng) 24 小時。

感染后第 3 天

再次計數(shù)細胞，估計細胞大小。如果實驗進展與預(yù)料一致，此時的細胞數(shù)目與第 2 天比應(yīng)該沒有增長。

如果細胞數(shù)目在感染后第 1 天和第 2 天之間就已經(jīng)停止增長，這說明所有的細胞在感染后第 1 天就已經(jīng)被全部感染，此時可以收獲細胞，因為感染時間已經(jīng)達到 48 小時，這是一般的情況。

如果細胞數(shù)目在感染后第 1 天和第 2 天之間仍然有一定增長，并且此時尚未達到平臺期，將搖瓶放回 27 ℃搖床，培養(yǎng) 24 小時。

感染后第 4 天

再次計數(shù)細胞，估計細胞大小。此時最好所有的細胞都被徹底感染、膨脹、生長停止，否則說明用于感染的病毒的量不夠，不能在細胞生長達到平臺期前使其停止。此時應(yīng)該收獲培養(yǎng)物，離心分離細胞，將培養(yǎng)液避光保存于 4 ℃，或者凍存于 -70 ℃。

通常最好將細胞沉淀凍存。我喜歡的方法是將細胞重懸于小量（比如 1/4 體積）的 PBS 或者 TBS （含有濃度為通常 5 倍的蛋白酶抑制劑）中，充分重懸后直接用微量移液器加入充滿液氮的干凈 Dewar 瓶中。滴下的重懸物遇到液氮迅速凍結(jié)形成小球，這些小球可以被分裝到 50ml 圓錐管中，凍存于 Revco 冰箱中。當(dāng)需要從細胞中純化蛋白時，只需將這些小球逐個加入到 3~5 倍體積室溫下不斷攪拌的裂解緩沖液中，它們將很快融化，使緩沖液降至接近 0 ℃。這些小球還可以用鑷子方便的轉(zhuǎn)移到 eppendorf 管中作小量實驗。