HPLC和UHPLC 色譜柱的十大誤區(qū)
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誤區(qū)10 空氣會徹底毀滅一根HPLC色譜柱
當(dāng)色譜柱不與色譜儀連接的時候，用戶需確保色譜柱被緊緊地密封。事實上，實際的應(yīng)用中是，即使柱的端部進入了少量的空氣也不要緊。因為當(dāng)你將色譜柱連接到色譜儀上使用時，在系統(tǒng)初始加壓階段，在很短的時間內(nèi)空氣就會被溶劑沖刷掉。所以，不要因為色譜柱進入了空氣而認定色譜柱已被損壞。
誤區(qū)9 所有的C18（L1）色譜柱都是一樣的
美國藥典委員會（USP）開發(fā)了一種分類系統(tǒng)，用來對每種類型的鍵合相柱進行分類。由于C18色譜柱是一種廣泛應(yīng)用的色譜柱，故該系統(tǒng)將其稱為“L1”。可惜不幸的是，大約有800種以上的L1流入了市場，因此，事實證明這個系統(tǒng)是不可靠的，是一個令人困惑的系統(tǒng)。
因為每種商品化的C18色譜柱，雖然同樣是選用硅膠作為基體，但各自都有自己特定的填料鍵合合成工藝，因此色譜性能也不相同。
譬如，有的生產(chǎn)廠商采用十八烷基一氯硅烷鍵合試劑和低表面積的硅膠（見圖一所示），而其它一些廠家采用同一硅烷試劑但選用了表面積更高的硅膠基體。
這兩種C18柱表現(xiàn)的色譜性能不同，后者C18固定相的鍵合比例大于前者。較低的固定相鍵合比率，表面未反應(yīng)的硅醇基較多，有時混合保留機理起主要作用。
某些色譜柱生產(chǎn)商使用二氯硅烷和三氯硅烷作鍵合試劑，將鍵合相聚合反應(yīng)形成一很厚的具有不同擴散特性的疏水層。為使鍵合后硅膠表面未反應(yīng)的硅醇基比例降低，有些生產(chǎn)商用小分子的硅烷試劑（如三甲基氯硅烷）封尾。
硅醇基是在中性條件下測定堿性物質(zhì)時導(dǎo)致色譜峰拖尾的原因之一，有些生產(chǎn)廠家，更進一步的做法是采用第二種小分子硅烷進行雙封尾工藝，以提供一個更加惰性（疏水性）的硅膠表面。
另外有些生產(chǎn)商采用聚合物基體材料進行C18鍵合，生產(chǎn)出一種完全不同的C18填料，但仍然被歸類到“L1”。還有廠家采用反應(yīng)性能不同的硅烷化試劑organoalkoxysilanes，制造出一種與氯硅烷反應(yīng)產(chǎn)生的不同的C18 固定相。
誤區(qū)8 反相色譜柱不可以使用純水相
這個誤解其實是起源于有些用戶在使用低有機溶劑含量或者純水作為反相色譜柱的流動相時，發(fā)生了俗稱相塌陷的現(xiàn)象，所以大家就認為反相色譜柱不可以使用純水相。
許多色譜工作者都被相塌陷現(xiàn)象和保留時間位移現(xiàn)象困擾著，甚至已經(jīng)失去了努力尋找解決途徑的耐心。因此，他們索性就認為不應(yīng)該在反相色譜柱中運行水含量很高的流動相。
然而，事實上市售的反相色譜柱（如極性嵌入和極性封端柱）都是具有水浸潤性的，其表面特性是允許使用純水的，而不會導(dǎo)致塌陷或者保留時間移位。
比如科思美析COSMOSIL的C18-PAQ系列則可以使用100%水作為流動相，適合分離親水型化合物，并相較于傳統(tǒng)的十八烷基鍵合硅膠色譜柱，具有很強的抗酸性。
誤區(qū)7 至少需要10個柱體積才能重新使LC色譜柱達到平衡
平衡時間對于梯度色譜來說是非常重要的，因為它是整個技術(shù)的限制因素。這有兩種平衡類型：重復(fù)平衡和完全平衡。重復(fù)平衡也就意味著在無法實現(xiàn)完全平衡的情況下達到的平衡。
實際上，如果在隨后的運行中，保留時間的重復(fù)性是小于0.002 min的，然后對于非離子化溶質(zhì)的無緩沖洗脫劑和堿性化合物以常用的三氟乙酸和甲酸為添加劑的話，重復(fù)平衡在兩個柱體積的范圍內(nèi)即可實現(xiàn)。
誤區(qū)6 相較之純的多孔粒子，表面多孔顆粒會顯著降低樣品容量
HPLC色譜柱填料對樣品的容量是與其表面積成正比的，這與硅醇基通過單體鍵合形成的化學(xué)鍵合相的量相關(guān)。然而，研究結(jié)果表明：在相同的試驗條件下，表面多孔顆粒與多孔粒子對樣品的容量是基本上相同的。
誤區(qū)5 UHPLC填料柱比常見的HPLC填料柱更容易堵塞
隨著柱填料多孔材料粒徑的不斷減小，使得柱的主要硬件設(shè)計跟著一起發(fā)生變化。對于sub-2μm UHPLC柱的堵塞，是樣品和流動相物質(zhì)倒伏在柱入口的結(jié)果。如果你在進樣前對樣品進行了凈化，如使用固相萃取、過濾或離心等，就可以避開任何污染問題。
誤區(qū)4 保護柱是沒必要的
使用保護柱有很多好處。首先，保護柱可以防止化學(xué)物質(zhì)或顆粒物損壞分析柱。其次，相較之更換一根昂貴的分析柱，更換一根5mm 的保護柱只需要很少的花費。現(xiàn)代的保護柱具有幾乎無死體積、更換快速，以及適用于UHPLC的高壓等優(yōu)點。
誤區(qū)3 你不可以將HPLC色譜柱反接以便于沖洗掉其中的顆粒物
實際上HPLC色譜柱的填裝壓力比最大使用壓力高很多（通常會高2倍）。如果裝柱時使用了恰當(dāng)?shù)膭驖{劑，并且分配一定的時間使柱床穩(wěn)定，一支填裝良好的色譜柱是完全可以雙向使用的。
液相色譜柱上基本都有->標(biāo)志，表示流動相的流動方向，有的在色譜柱上印有“Nerver Lot Flow in the Opposite Direction”字樣，翻譯成“決不能反沖”的意思，色譜柱可以反沖嗎、色譜柱能不能反沖的問題爭議很大，但在我們工作中，用色譜柱反沖技術(shù)修復(fù)色譜柱可以收到柱效提高、柱效恢復(fù)的效果。
一、分析氨基酸的離子交換柱，使用一段時間反柱效明顯下降，用NaOH活化，達不到要求，但用NaOH反沖活化可迅速恢復(fù)柱效。
二、色譜柱使用一段時間后柱效下降，此時可拆下柱入口端螺帽，去掉1-2mm被污染填料，再用相同填料填滿，然后用流動相反沖一下，可使柱效恢復(fù)，因反沖可以改善柱頭死空間。
三、因反沖可把沉積在過渡板上的細微顆粒沖走，有時也可用反沖技術(shù)使柱壓降低。
反向使用色譜柱有一個例外，就是生產(chǎn)商在色譜柱的進樣端使用了孔徑更大篩板的情況，反向使用可能會將填料從柱床沖出。如果制造商在柱的入口處使用的是高孔隙率的玻璃料，那么將柱反沖的話，可能會將柱填料從填充床上沖洗掉。
色譜柱在工廠填裝時，出口端的篩板孔徑必須比色譜柱中最小顆粒的粒徑還要小。譬如，色譜填料平均粒徑是5μm，粒徑分布范圍是3-7μm，出口端篩板孔徑必須小于3μm，使填料沒有可能從柱床跑到色譜柱篩板外面。
大多數(shù)生產(chǎn)廠家選擇的篩板孔徑是2μm。 至于某些廠家兩端的柱篩板孔徑不一樣，一般是進樣端大些，出樣端小些。因此，一些制造商會在柱子標(biāo)簽處放置一個箭頭指示，表明必須僅在一個方向上使用。可以肯定有這種可能性，所以一個色譜工作者應(yīng)該好好閱讀色譜柱手冊或說明書，或與制造商確定這根色譜柱是否可以反沖。
誤區(qū)2 色譜柱填料粒徑越小、壓力越高，分離效果越好
超小的粒徑以及超高的柱壓，并不一定是色譜工作者的最佳選擇！現(xiàn)代色譜柱的柱特性研究已經(jīng)引發(fā)出一些新方法來評估一根色譜柱的性能。例如，采用新的表面多孔材料的色譜柱，其柱效與sub-2μm UHPLC柱效一樣好，然而與常規(guī)的LC填料色譜柱比起來，柱壓很低。
誤區(qū)1 柱壓不會影響色譜分離效果
色譜的很多參數(shù)都是受柱壓影響的，包括部分溶質(zhì)的摩爾體積、停滯體積、柱孔隙度、保留因子、流動相密度、介電常數(shù)、固定相結(jié)構(gòu)、pH值和電離常數(shù)等。為什么柱壓引起了越來越多的關(guān)注呢？原因是市售的色譜儀很多是超高壓色譜儀和色譜柱。
當(dāng)色譜柱在約2000psi（13.789MPa）壓力下運行時，即使保留時間上存在小差異，也并不會引起我們的注意；特別是如果重復(fù)性較好及定量不受影響的時候。但是，當(dāng)柱壓接近2000psi（13.789MPa）時，柱壓的影響可能就相當(dāng)明顯了。
