堿水解和由二吲哚碳酰的活化實(shí)驗(yàn)
原理
材料與儀器
酶溶液
磷酸鉀 NaCl NaOH 二氧雜環(huán)乙烷 羰基二咪唑
吸濾器 聚酯小片
步驟
實(shí)驗(yàn)所需「試劑」具體見「其他」
1. 堿解和活化
聚酯小片（每片 2 cm2，10 片）在 10 ml 10％（質(zhì)量濃度）NaOH 中室溫孵育 10 min。用水沖洗五次，每次 10 ml，之后浸沒在二氧雜環(huán)乙烷中 30 min，然后用二氧雜環(huán)乙烷沖洗五次以去除殘留的水。其后，聚酯小片在溶有 35 g/l 羰基二咪唑的二氧雜環(huán)乙烷中孵育 30 min。最終用二氧雜環(huán)乙烷沖洗五次、用 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸鉀沖洗三次。
2. 酶的偶聯(lián)
聚酯小片浸沒在 10 ml 的酶溶液中，在室溫過夜孵育，對(duì)于敏感的酶在 4℃ 孵育。在吸濾器上先用溶有 0.5 mol/L NaCl 的 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸鉀沖洗，再用 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸鉀沖洗，以去除未結(jié)合的酶。聚酯小片能在緩沖液中 4℃下儲(chǔ)存一周。為了儲(chǔ)存更長時(shí)間，必須用水短暫沖洗這些聚酯小片后在空氣中干燥（不推薦在敏感的酶中使用）。
常見問題
試劑：
0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸鉀
溶有 0.5 mol/L NaCl 的 0.1 mol/L 磷酸鉀，pH7.5
100 g/l NaOH
二氧雜環(huán)乙烷
溶有 35 g/l 羰基二咪唑（CDI，Mr＝162.2）的二氧雜環(huán)乙烷
