用PCR擴增cDNA庫中的特異序列
最常用的基因分離方法需要建立組織或細胞RNA的cDNA庫，然后用抗體或 DNA探針篩選出感興趣的基因。雖然這個方法已成功地克隆了大量基因，但建立和篩 選CDNA庫是一項非常耗時．費力的工作，而且用寡聚核苷酸作探針進行篩選需大量蛋 白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)的資料。 聚合酶 鏈的反應(yīng)（PCR）方法可使一種特異DNA擴增幾百萬倍， 并已成為分子克隆和診斷的十分有用的工具。最近，TAQDNA 聚合酶 的使用極大地簡化 了PCR方法。該酶在75℃左右有很寬的最適溫度區(qū)，在小于95℃以下重復保溫仍能存 活，更重要的是，該酶活性高，無外切酶活性，因此理論上不用通過建立和篩選基因 庫的所用步驟就能從序列編碼的基因作模板以探索一種簡單．快速的基因分離方法。 下面我們將描述在鑒定南美蝙蝠唾液腺外分泌蛋白中使用的方法和過程。
Dr.S.Gardell(MSDRL，WestPoint，PA)純化了從南美蝙蝠唾液腺中分離的一種外 分泌蛋白，因此其部分肽序列(GlyLeuGlyCysAspLeuMet)是開始本實驗的關(guān)鍵。為檢 驗不用傳統(tǒng)篩選方法即能克隆該蛋白基因的假說，我們采取了如下策略:
a).在Lambdagt22中建立一個在蝙蝠唾液腺中所有轉(zhuǎn)錄子的cDNA庫，并在邊側(cè)加 上SP6、T6聚合酶啟動子，這樣可以直接用兩種啟動子序列之一作引物進行擴增和測 序。
b).合成四組引物，組合起來代表已知的部分蛋白序列的全部有效密碼子組合 (1024種衍生列)。C).這些引物與適當?shù)腡7或SP6聚合酶序列引物組合成對，以總cDNA 庫作模板，進行PCR擴增。所得到PCR產(chǎn)物應(yīng)該代表編碼該蛋白的部分cDNA。對這些 PCR產(chǎn)物直接測序應(yīng)能得到足的序列信息以合成同源引物，進一步進行PCR擴增，產(chǎn)生 的DNA片段結(jié)合起來可給出編碼該蛋白的cDNA的完整序列。
直接用2% 瓊脂 糖凝膠分析PCR產(chǎn)物，組混合引物[引物1:5"(CT)TXGG(ACGT)TG(CT) GA (CT)(CT)TXATG3"，。每組混合引物產(chǎn)生約450bp和550bp的兩個產(chǎn)物。用Wong等所 述的方法進行凝膠純化和測序該PCR的主要產(chǎn)物450bp帶。混合引物產(chǎn)生清蜥可讀的序 列(約200個核苷酸)，雖然可有256種引物組人合(簡并度)。在這個序列信息的基礎(chǔ) 上，合成另兩組引物[引物Ⅱ(正向)]分別與SP6或T7聚合酶序列引物配對，按前面所 述進行PCR擴增，引物Ⅱ/SP6和引物Ⅲ/T7分別產(chǎn)生270bp和420bp片段，測定這兩個片 段序列，與最初得到的DNA片段結(jié)合來，得到一個467bp編碼序列。該cDNA(270BP+420 bp)的多余序列為200bp的PolyA尾序。
PCR策略
(A)n、(C)n、(G)n、(T)N:同聚物序列SP6，T7:SP6和T7聚合酶啟動子，分別構(gòu)建 入Lambdagt載體。B. 瓊脂 糖凝膠分析PCR產(chǎn)物。PCR在總體積100μl，含50mMKCL、 10mMTris，pH8.3，1.5mMMgCl2，0.01%明膠，200μM每種dNTP，2.5uTup聚合酶， 150ng噬菌體庫模板DNA，50ng(0.1nmoles)每種引物的體系中進行。程序如下:初始模 板變性94℃，8分鐘;之后為94℃2分種，60℃3分種，30個循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用氯仿 抽提以除運送放物油，從100μl中取5μl樣品加到2%瓊脂糖凝膠上。溴化乙啶染色。
GGATGACCACCCACAGCAGCTGCCTAACCATGAAGCTGGTGACCATCCTCATGCTGACC
GCCCTCCCCCTGTACTGETATGCGGGGCTTGGELGEGATCTTATGGACAATGTGGTCAAR
TTGACCATCGATTCTAATGTGGACGTGAATACATACATCGATAACCTGAAAGAGTTCCTA
CCAGGTGAAGAAACTCAAGAGGCCTTCAAATTCATGAAGGAATGCTTTETCGATCAGAGC
GAAGAAACTCTGGAGAAGATCAAAGTTCTGCAGCAATCGATATACAGTAGCGTTTGGTGT
GCTCGGGACACTAACTTCACATGACCACAGAGATTGTCCACAGACCAACTGTCCATTGG
TAGAAGCCECAGCTGAGCTTTCCTTCTTCATCCTTCGATCTACAAATGCAAGACAATTGT
AAACCTGACATACGTTTGEATTTCAATAAAGCATCCTGCAAAACCAAAAA
核苷酸序列及預測的 氨基酸 序列。從制備性瓊脂糖凝膠中分離PCR產(chǎn)物，并按廠 商說明書(Bio101)用Geneclean純化。按廠商說明書(美國Biochemical序列酶)，用 32P5"末端標記引物和修飾過的T7聚合酶(測序酶)測序。每個反應(yīng)含100ng(0.4pmoles )模板DNA和20ng(4pmoles)5"32P末端標記的引物，每反應(yīng)為2卓106cpm。劃線部分為 起始本實驗的多序列。計算機分析表明該cDNA含有一個可讀框，編碼110個 氨基酸 ， 起始的18個氨基酸推測為信號肽，還發(fā)現(xiàn)用于起始這種蝙蝠唾液蛋白實驗的七個氨基 酸在蛋白的N-末端(圖2，劃線部分)。檢索NBRF數(shù)據(jù)庫揭示該蛋白與鼠前列腺類固醇 結(jié)合蛋白C3鏈前體有39%的同源性，最重要的同源性是成熟蛋白中所有三個半胱氨酸 殘基的位置。
我們已經(jīng)證明聚合酶鏈反應(yīng)可以用于從復雜分子庫如cDNA庫擴增特異的DNA序 列。在本實驗中專門設(shè)計的Lambd gt22載體，通過用含有適當內(nèi)切酶位點和聚合酶啟 動子序列的5"端、3"端引物接頭定向克隆cDNA分子。從克隆的PCR產(chǎn)物制備序列特異 的探針，用傳統(tǒng)方法篩選基因庫，我們估計分離cDNA的豐度為每10，000個噬菌體重 組子中有1個克隆。用一組代表簡并度為256的寡聚 核苷酸 引物能進行特異擴增的事實 進一步表明了該方法的靈敏度，而且如圖1B所示，所有四個引物混合物產(chǎn)生相同PCR 產(chǎn)物，表明具有更大簡并度的寡聚 核苷酸 引物庫也能進行特異擴增，PCR可以容忍1個 堿基對的錯配。
PCR方法、混合引物和PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)合起來，可極大地減少建立cDNA庫的時 間，擴大該方法的用途。
