帕金森病模型的制作實(shí)驗(yàn)

原理

帕金森病(Parkinson disease, PD)是中老年常見的基底節(jié)神經(jīng)元進(jìn)行性退行性疾病，主要累及黑質(zhì)和紋狀體多巴胺遞質(zhì)系統(tǒng)。6-脛基多巴胺(6-0HDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)是兩種主要的多巴胺能神經(jīng)毒性物質(zhì)，可以很好的模擬PD患者的臨床表現(xiàn)和病理改變。由于6-OHDA不能通過血腦屏障，需立體定向注入腦內(nèi)，目前多采用黑質(zhì)致密部(SNc)、紋狀體(cs)、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)、前腦內(nèi)側(cè)束(MFB)等部位進(jìn)行注射；MPTP有高度的親脂性，易通過血腦屏障，選擇性濃集于黑質(zhì)，通常經(jīng)腹腔或皮下注射。

材料與儀器

雄性SD大鼠 體重200-250g 雄性C57 BL小鼠 體重20-25g
6-OHDA和MPTP(Sigma公司）
立體定位儀(NarishigeJAPAN) 顱骨鉆 吸引器 1μL或5μL微扯注射器

步驟

1.6-OHDA致大鼠PD模型的制作：

(1)SD大鼠稱重，按每籠5-6只飼養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)，將大鼠以1%戊巴比妥鈉麻醉，待動(dòng)物失去知覺即可開始操作。

(2)大鼠用立體定位儀將雙耳及門齒固定。自矢狀縫皮膚劃開，棉球止血，定位，鉆孔，挑破腦膜（以黑質(zhì)致密部單側(cè)損毀為例，參照Paxinos圖譜確定注射坐標(biāo)，前顱后5.2mm,左側(cè)或右側(cè)旁開2.2mm,進(jìn)針深7.8mm)。

(3)微量注射器注射，以濃度2μg/μL，注射速度1μL/min注射，并留針10min,以1mm/min的速度退針。止血，縫合傷口。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物蘇醒的過程中，注意保溫，觀察各項(xiàng)生命體征。156第四章，神經(jīng)系統(tǒng)疾病常用動(dòng)物模型的制作在手術(shù)后的數(shù)周內(nèi)，觀察動(dòng)物的進(jìn)食、體重、行為學(xué)變化等情況。單側(cè)損毀的方法，技術(shù)上比較成熟，操作較易、死亡率低，模型相對(duì)穩(wěn)定，易區(qū)分雙側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)細(xì)小異常，能對(duì)比患側(cè)黑質(zhì)的手術(shù)前后及與正常側(cè)表現(xiàn)。雙側(cè)毀損是較大范圍神經(jīng)化學(xué)和行為學(xué)損傷，更似人類PD。但對(duì)基底節(jié)下丘腦等特殊區(qū)域損傷較大，死亡率很高，且操作較繁瑣，目前PD實(shí)驗(yàn)研究中較少應(yīng)用。:

2.MPTP致小鼠PD模型的制作：

C57/BL小鼠稱重，每籠5-6只左右。戴手套將小隊(duì)的頭頸部、尾部固定，經(jīng)腹腔或皮下注射，單次注射的劑瞿為20-30mg/kg。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和目的，可分為快速模型和慢速模型。快速模型可分為單次注射和多次注射。單次注射的劑最為30mg/kg,該模型損傷輕，易恢復(fù)；多次注射的劑量為20mg/kg,每隔2h注射1次，共3-4次，該模型損傷快且嚴(yán)重，DA神經(jīng)元的損傷到死亡可以在3d內(nèi)完成。慢速模型需多次注射，每天1次，單次注射的劑量為20mg/kg,連續(xù)注射5-7d。該模型的成活率較高，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。

3結(jié)果判定：PD模型可通過體重檢測(cè)、旋轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸掛測(cè)試等進(jìn)行評(píng)價(jià)。黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的損傷程度可通過阿撲嗎啡（或苯丙胺）引發(fā)的向健側(cè)（或傷側(cè)）旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)來(lái)較好地評(píng)估。與對(duì)照組相比，成功的模型組會(huì)出現(xiàn)明顯的體重增加緩慢、自主活動(dòng)減少等特點(diǎn)。另外，通過免疫組化或分子生物學(xué)的方法觀察黑質(zhì)、紋狀體等部位的TH表達(dá)的明顯減少也是判定PD模型成功與否的一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)。

注意事項(xiàng)

1.MPTP有劇毒，在稱量溶解和注射時(shí)一定做好個(gè)人的防護(hù)工作；MPTP、6-OHDA等試劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

2實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物較多，一定要做好標(biāo)記，以免混淆，造成實(shí)驗(yàn)失敗。

3.SD大鼠在造模后，一定注意保溫、吸痰。根據(jù)大鼠的夜間習(xí)性，下午或晚上造模的成活率更高些。

4.小鼠應(yīng)激反應(yīng)較強(qiáng)，抓取時(shí)應(yīng)帶厚的手套，以免被咬到。

5.小鼠在注射MPTP后30min內(nèi)會(huì)出現(xiàn)顫抖、口角抽揣、肢體平衡能力差等一系列行為學(xué)的改變，可能是MPTP對(duì)腎臟、肝臟等器官產(chǎn)生的毒害作用引起的一些生理指標(biāo)，如血壓、體溫和肝功能等的變化。因此，應(yīng)在MPTP最后一次注射后第3天或第4天以后再進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，更能客觀地檢測(cè)小鼠PD模型的行為學(xué)變化。

6.6-OHDA致PD模型定位注射時(shí)注射速度宜緩慢，過快可導(dǎo)致注射范圍擴(kuò)散；微量注射器選擇時(shí)避免注射針頭過粗造成損毀區(qū)域增大。

7.進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，盡星避免外界環(huán)境（嘈雜、強(qiáng)光等）的干擾。

常見問題

造模的成功與否，決定了進(jìn)行各相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)址的好壞。制備PD模型選取時(shí)需綜合考慮造模目的和用途、靶點(diǎn)的位置(SN,CS、vTA、MFB)、藥物劑量多少和浸潤(rùn)范圍大小、損傷的程度（部分、完全）、動(dòng)物的安全性（死亡率）和有效性（成功率）、操作難易性、精確性和穩(wěn)定性等等。因此，在兩模型具體應(yīng)用時(shí)要有所選擇：

① 根據(jù)藥物特性選擇建模方法6-OHDA需立體定向注入靶位、MPTP經(jīng)腹腔或皮下注射；

② 根據(jù)藥物敏感性選擇動(dòng)物大鼠對(duì)6-OHDA敏感，制備模型時(shí)按前述因素綜合考慮，靈長(zhǎng)類對(duì)MPTP最敏感但受限制，而常用小鼠；

③ 根據(jù)應(yīng)用目的和用途選擇模型6-OHDA注射靶位選取靈活，注射劑量可調(diào)，動(dòng)物行為變化穩(wěn)定可靠，檢測(cè)量化性好，多用于PD的臨床前藥物研究和藥理療效判定、神經(jīng)保護(hù)、細(xì)胞移植和基因治療等方面的研究，MPTP用藥方案多樣，誘導(dǎo)產(chǎn)生的癥狀及病理、生化改變方面與人類PD更相似，主要用于PD病因、發(fā)病機(jī)制，藥物毒理試驗(yàn)等研究。