夾心 ELISA

原理

「夾心」 ELISA

夾心法是免疫檢測中最簡單和最有用的方法之一，它可用于檢測樣品中抗原的濃度(圖 14.1)。將一種抗體包被到酶標板中。當把包含靶抗原的溶液加入微孔中時，包被的抗體捕獲抗原，仔細洗滌去除未結合抗原。二抗識別的是被一抗捕獲在固相表間上的抗原的不同表位。洗滌去除過量的二抗。二抗通常被標記從而有助于進行定量檢測。

「夾心」E L IS A 除了快速和簡便的特點外，還具有精確性和可重復性，并且抗原不需要精制。

「夾心」E L IS A 的靈敏度依賴于多種因素，如捕獲抗體是否有效地結合到酶標板上，抗體的親和力及二抗的「特異性」
等 。

操作步驟

(1) 每孔中加人 50^1 抗體溶液（2 〇 pg/m l，溶 于 PBS) ，將捕獲抗體包被在酶標板表面 。雖然每個實驗都是不同的，但 每 孔 1 ug 抗體是很好的開始 。室 溫 孵 育 1h或 4℃過夜。

(2) PBS 洗 板 2 次 。該步驟可用多道微量移液器或噴壺操作。

(3) 用封閉緩沖液封閉剩佘的蛋白結合位點。通常使用的封閉液是 3 % 小牛血清白蛋白或脫脂奶粉溶液 (溶于 PBS 或 TBS)。孵 育 l h

(4) PBS 洗 板 2 次

(5) 各孔中加人系列稀釋的抗原溶液 50 jul。用封閉液（3 % 小牛血清白蛋白/pBS) 對抗原進行稀釋。在濕潤環境中，室溫解育至少 2 h 。

(6) PBS 洗 板 4 次 。

(7) 加人標記的二抗。該抗體加入的總量應通過預實驗來決定。為精確定量，二抗應該是過量的。用封閉液對二抗進行稀釋。

(8) 在濕潤環境中，室溫孵育 2 h 或更長時間。

(9) PBS 洗板數次。

(10) 按廠商說明所述加人底物作為指示劑。在顯色反應到達建議的孵育時間后，通過酶標儀在適合的光密度條件下進行讀數。

為了得到定量的結果，未知樣品的信號可與標準曲線進行比較。為了確保實驗的精確性，每次實驗中都應加入標準品。

操作注意事項

(1) 疊氮鈉是過氧化物酶的抑制劑。如果使用 H R P 標記的抗體，緩沖液或漂洗液中不要包含疊氮鈉。

(2) 如果酶標板用于今后使用，必須將之按儲存要求而制備。低溫儲存、冷凍干燥或在包被液中加人糖類或甘油都是可以的。對于任何特定的抗體酶標板，最好的方法是通過經驗來決定。

(3) 因為潛在的致癌性，一些酶的底物被認為是有害的。小心操作，參考安全手冊，進行適當的預防。注意疊氮化物是劇毒物質。