聚丙烯酰胺凝膠電泳法

原理

不同種乃至不同變種的生物不但外部形態(tài)有變異，由于結(jié)構(gòu)基因的差別，其表達(dá)產(chǎn)物酶和蛋白質(zhì)也必然存在著一定的差別。所以同工酶分析作為一種遺傳分析手段已廣泛應(yīng)用于品種資源調(diào)查、雜交子代測(cè)定、種子純度鑒定等農(nóng)林業(yè)各個(gè)領(lǐng)域，在指導(dǎo)生產(chǎn)方面發(fā)揮了很大的作用。此外，同工酶分析對(duì)研究不同產(chǎn)地、不同種屬生物間的親源關(guān)系和開(kāi)發(fā)利用藥物植物資源方面也有積極的意義。

材料與儀器

愈創(chuàng)木酚
聯(lián)苯胺 冰乙酸 乙酸鈉 硫酸錳 過(guò)氧化氫 TMEM 過(guò)硫酸銨 瓊脂
電泳儀 垂直板電泳槽 微量加樣器 燒杯 試管 長(zhǎng)滴管 平皿

步驟

1.樣品液制備:取材料莖部1 g加兩倍冷純凈水，在冰箱預(yù)先冷卻的研缽中充分研成勻漿，然后離心（3500 r/ min，20 min），加等體積甘油和少許溴酚藍(lán)指示劑即可。
2.凝膠制備（按“常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳”），加樣量40μl/孔，電壓180 V，電泳時(shí)間2.5～3 h。
3.染色:0.5 g聯(lián)苯胺溶于250 ml 10%冰乙酸，配成聯(lián)苯胺母液。1.35 g愈創(chuàng)木酚溶于250 ml 10%冰乙酸，配成母液。染色液為100 ml 0.2mol/L乙酸鈉溶液，10 ml 5 mmol/L硫酸錳溶液，25 ml聯(lián)苯胺母液，40  ml愈創(chuàng)木酚母液，25 ml 0.12%過(guò)氧化氫溶液（臨用前配制）。凝膠洗出后轉(zhuǎn)移至染色液中，37 ℃恒溫下放置30 min，顯色后，置7%乙酸中保存，繪圖或照相。