腎小管上皮細胞傳代培養

簡介

人腎小管上皮細胞 HK-2 屬源于正常腎的近曲小管細胞，通過導入 HPV-16 E6/E7 基因而獲得永生化。

用途

用于 HK-2 細胞實驗。

材料與儀器

CO2 培養箱、倒置顯微鏡、超凈臺、離心機、37 ℃ 水浴鍋、HK-2 細胞、DMEM/F12 培養基、FBS、0.25% 胰酶、PBS、培養皿、15 mL 離心管、凍存管、記號筆。

步驟

1、細胞復蘇：

從液氮罐中取出要復蘇的細胞凍存管，迅速置于 37 ℃ 水浴鍋中，輕微搖晃凍存管使細胞凍存管中的培養液快速融化（最好在 1 min 內完成），隨后 1 000 rpm 離心 5 min，小心從離心機中取出細胞凍存管；

放入超凈工作臺中，棄去凍存管中的上清溶液，然后加入 1 mL 完全培養基（90% DMEM/F12+10% FBS），用移液器將細胞吹成單個細胞懸液，吹打時動作輕柔，將細胞懸液移轉至無菌細胞培養皿，加入適量完全培養基，置于 37 ℃ 5% CO2 細胞培養箱中培養。

2、細胞傳代：

在顯微鏡下觀察細胞的密度，細胞長至 80% 左右可以考慮傳代，如細胞較稀，請及時換液。從 CO2 培養箱取出細胞培養皿，用移液槍吸棄去細胞培養皿中的陳舊培養基，使用事先預熱至 37 ℃ 的 PBS 溶液洗滌細胞兩次并棄去以消除血清對后續胰酶的中和作用的影響。

加入 1~2 mL 的胰酶消化細胞，輕微搖晃細胞培養皿，使得胰酶能完全浸潤細胞表面，在顯微鏡下觀察細胞（注意不同細胞的消化時間不同，放入 37 ℃ 培養箱可促進胰酶消化活性）；

待細胞回縮變圓、細胞間隙增大后（HK-2 細胞大概 1~2 min，注意盡量避免細胞大面積從培養皿底部脫落，防止消化過度），棄去胰酶，加入 1~2 mL 完全培養基終止消化，將細胞從培養皿表面吹下，輕柔吹打細胞形成單個細胞懸液，將細胞懸液混勻后分狀至新的細胞培養皿，并加入適量完全培養基繼續培養；

3、細胞凍存：

事先配好細胞凍存液（完全培養液 92%，DMSO 8%）。將處于對數期生長的細胞按照細胞傳代步驟進行消化，將細胞吹打成單個細胞懸液后，收集細胞至 15 mL 離心管中，1 000 rpm 離心 5 min，棄去上清，加入上述細胞凍存液，使用移液器吹吸混勻后，加入無菌細胞凍存管中；

在凍存管上標注細胞名稱及凍存時間后，4 ℃ 放置 1 h，-20 ℃ 放置 2 h，-80 ℃ 放置過夜后（也可將細胞放入常溫的細胞凍存盒后，直接放入 -80 ℃ 冰箱過夜），置于液氮罐中長期保存，注意做好標記。

注意事項

1、細胞操作都需在無菌條件下操作，嚴防污染。

2、HK-2 細胞對血清質量要求高，推薦使用優等胎牛血清。

3、在細胞復蘇操作時，應注意融化凍存細胞速度要快，而在細胞凍存時，要逐步降溫凍存或者放入細胞凍存盒中，遵循慢凍速溶原則

4、HK-2 細胞為上皮細胞樣貼壁細胞，在甲基纖維素、軟瓊脂上不生長且不能懸浮培養。

5、HK-2 細胞生長緩慢并且需要一些時間才能貼壁。在培養基中看到許多圓形、漂浮和折射細胞是正常情況，不應丟棄松散附著和圓形的漂浮細胞，收集離心后可重新加入到培養皿中。

6、HK-2 細胞培養密度不宜過高，建議 80% 密度及時傳代，2~3 天更換新鮮培養基，按 1:2 至 1:4 進行傳代，使用 0.25% 胰酶消化 1~2 分鐘。