內皮細胞屏障的通透性檢測

簡介

內皮屏障功能的變化可調控血管向組織的滲漏，以維持穩態。內皮細胞通透性改變在多種疾病的病理生理過程中具有重要的意義，目前已建立了一系列體內外內皮細胞屏障通透性的檢測方法。

原理

伊文思藍是一種常用的偶氮染料，與血漿白蛋白有很高的親和力，可用來標記白蛋白。在生理條件下，內皮不能滲透白蛋白；而在病理條件下，內皮細胞間連接蛋白功能障礙導致屏障通透性增加，此時，可在單層內皮細胞模型中檢測到伊文思藍-白蛋白的滲漏。

用途

在體內及體外模型中評估內皮屏障的通透性。

材料與儀器

Transwell 細胞小室，細胞培養板，細胞培養基，跨膜細胞電阻儀，伊文思藍（EB），牛血清白蛋白（BSA）。

步驟

1. 單層細胞屏障建立： 細胞消化、計數并調整細胞濃度至 1×105 細胞/mL，移液器取 1 mL 細胞懸液接種于孔徑為 3 μm 的 Transwell 小室中，并將小室插入 24 孔細胞培養板，培養板下室提前加入 1 mL 完全細胞培養基，置于 37 ℃，5% CO2 細胞培養箱中，每兩天使用細胞電阻儀測量一次跨膜電阻（TEER）并記錄數值，至 TEER 穩定且持續時，認為單層細胞屏障形成；

2. 伊文思藍-血清白蛋白（EB-BSA）工作液配制：2% EB 貯存液與 60 倍體積的 4% BSA 混合，用 PBS 稀釋至終濃度為 0.67 mg/mL；

3. 伊文思藍滲漏測定：取出 Transwell 小室，PBS 洗 2 次后，放入新的 24 孔板，下室加入 600 μL 4% BSA 溶液，上室加入 100 μL EB-BSA 工作液，以保證上室與下室液面高度一致，消除液面高度差引起的液體滲漏，于 37 ℃，5% CO2 細胞培養箱中平衡 1 h；

4. 滲透性評估：① 取出 Transwell 小室，吸取下室液體于 1.5 mL EP 管中，1 000 rpm 離心 5 min，取 200 μL 加入 96 孔板；② 另將 EB-BSA 工作液（初始濃度為 0.67 mg/mL）倍比稀釋，分別取 200 μL 加入 96 孔板，使用多功能酶標儀在 620 nm 波長下測量 OD 值并制作標準曲線；③ 根據標準曲線計算 Transwell 下室液體中 EB 濃度，該濃度代表由上室滲漏至下室的伊文思藍的含量，即單層內皮細胞的通透性。

注意事項

1. 根據實驗需要可選擇不同孔徑的 Transwell 小室，常用 0.4 μm~3 μm 孔徑；

2. 造模前需確認屏障的完整性，可通過跨膜電阻（TEER）檢測評估完整內皮屏障的形成；

3. 檢測 EB-BSA 滲漏時，需保證 Transwell 上室及下室液面一致，避免因液體高度差所引起的滲漏。

常見問題

1. 推薦接種的細胞密度是多少？

不同的實驗使用細胞種類不同，培養時間和方法亦有區別，建議參考文獻。

2. 是否需要對小室膜進行包被，如膠原蛋白包被？

一般來說，若細胞在 TC 處理表面的培養器皿中進行培養時貼壁狀態良好，則不需要對小室膜進行額外的包被處理。只有在細胞貼壁狀態不好，并且在之前的培養中都需要進行包被，才需要對小室膜進行包被，但請注意包被層可能會影響到后續物質交換，建議參考相關文獻。

3. 內皮細胞在 Transwell 小室中生長不均勻。

為優化細胞在 Transwell 小室上的生長，應避免培養瓶接種培養細胞后，底部細胞覆蓋率超過 85%~90%；完成細胞接種后，務必小心地將 Transwell 板轉移至培養箱中。避免將含有懸浮細胞的培養基從 Transwell 小室泄漏至培養板中。

4. TEER 值不穩定。

在進行單層內皮細胞模型的 TEER 測定之前，將小室平衡至室溫，可以獲得更為統一的測定結果，不同內皮細胞平臺期 TEER 值也不盡相同；請注意上室與下室中液體的體積會影響測定數值，請嚴格統一每次測量時的工作體積。