α 突觸核蛋白超聲處理實(shí)驗(yàn)操作步驟（適用于 tau, Aβ 等其他活性蛋白）

材料與儀器

材料：超聲管

儀器：通風(fēng)櫥、非接觸式超聲波破碎儀或探頭超聲波儀（帶 1/8”尖端的超聲儀）

步驟

超聲前后準(zhǔn)備 PFF 的步驟：

1. 收到原纖維后，立即將它們儲(chǔ)存在 -80℃。

2. 提前計(jì)劃好需要嘗試的超聲處理設(shè)置和原纖維的量以便實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

3. 37℃ 下解凍超聲實(shí)驗(yàn)所需的原纖維的量。

4. 分裝到多個(gè)超聲管中，并按之前計(jì)劃好的在不同的時(shí)間和設(shè)置下對(duì)它們進(jìn)行超聲處理。

5. 通過(guò)電鏡（EM） 查看上述經(jīng)過(guò)超聲處理的樣品，尋找纖維尺寸分布為 ~50nm 的樣品，記錄為最佳超聲處理設(shè)置。

6. 解凍未超聲處理的原纖維（收到后儲(chǔ)存在 -80℃ 的原纖維）。

7. 在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前在最佳超聲處理設(shè)置下進(jìn)行超聲處理（為達(dá)到最好實(shí)驗(yàn)效果，我們建議是在進(jìn)行超聲處理后立即使用，但如果工作流程不允許，替代方法是：在最佳超聲處理設(shè)置下進(jìn)行超聲處理，等分到所需劑量（體積) ，冷凍等分試樣以備后用。然后他們可以在注射前根據(jù)需要解凍超聲處理的等分試樣）。

非接觸式超聲波破碎儀操作設(shè)置:

使用 1.5mL 微量管（Microtubes）加蓋，至少 100uL 樣本體積（建議 100-300uL），30 秒開(kāi), 30 秒停, 5 個(gè)高頻循環(huán)。（注：儀器頻率/功率范圍為 20-60kHz 和 25-210 瓦。） 

我們建議在較高濃度下進(jìn)行超聲處理，然后再進(jìn)行稀釋。超聲處理會(huì)增加材料的溶解度和均勻性，因此超聲處理之后再移液和稀釋會(huì)更準(zhǔn)確。

由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境還有儀器的不同，并沒(méi)有一個(gè)一勞永逸的黃金法則，最好的選擇是使用您現(xiàn)有的超聲儀根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)需求優(yōu)化超聲處理方案。可以通過(guò)沉降分析尋找大部分原纖維變得可溶的超聲參數(shù)，或使用 AFM/TEM 確定原纖維長(zhǎng)度<50nm 的超聲參數(shù)。

探頭超聲波儀操作步驟（改良自 Michael J Fox 機(jī)構(gòu)）

在通風(fēng)櫥或生物安全柜中執(zhí)行所有超聲處理的步驟。確保通風(fēng)柜采用外部管道，不會(huì)將廢氣再循環(huán)到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。

1.在 37℃ 下解凍足量的 5mg/mL PFF 然后立即使用。建議再次測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，因?yàn)閮鋈诳赡軙?huì)改變蛋白質(zhì)濃度。

2.將 PFF 添加到含有適當(dāng)體積的無(wú)菌 dPBS 的無(wú)菌微量離心管中，將 PFF 稀釋至所需濃度。（注：對(duì)于小鼠注射，我們通常使用 2-2.5mg/mL 的 PFF。）

3.使用探針超聲儀，以 2 檔功率超聲處理總共 60 個(gè)脈沖（每次約 0.5 秒）。在每 10-12 個(gè)脈沖之間暫停一下，以防止溶液過(guò)度加熱并避免起泡。

注意事項(xiàng)

我們還使用高能水浴超聲波儀測(cè)試了該操作步驟，到目前為止的結(jié)果表明該步驟也適用于對(duì) PFF 進(jìn)行超聲處理。水浴超聲波儀可以對(duì)封閉管進(jìn)行超聲處理，對(duì)于這種可能生成危險(xiǎn)氣溶膠的操作比較安全。然而，當(dāng)使用浴式超聲處理代替探頭超聲處理時(shí)，同樣需要確認(rèn)原纖維在 ≤ 50nm 的長(zhǎng)度，以達(dá)到合適的毒性。