施萬細胞的原代培養實驗
原理
施萬細胞是周圍神經系統的成髓鞘膠質細胞，能有效地促進外周神經的再生。近年的研究表明，施萬細胞也能改善中樞神經再生的微環境，因此體外培養施萬細胞勢在必行。目前最簡便、快捷分離純化施萬細胞的方法是差速貼壁法，即根據不同細胞在培養器皿上貼壁速度的差異，去除成纖維等污染細胞，以獲得高純度施萬細胞。
材料與儀器
新生1-3d的大、小鼠仔鼠 2月齡成年大、小鼠
含10%胎牛血清DMEM培養基 0.05% Collagenase-Dispase 10μg ml層黏連蛋白(Laminin)
培養瓶
步驟
1.新生鼠施萬細胞的獲得
依照總論的方法消毒動物后詳細步驟如下。無菌條件下分離出背根神經節，用含10%胎牛血清DMEM培養液吹打分散成細胞懸液（詳見背根神經節細胞培養章節）。或分離提取動物雙側坐骨神經，PBS沖洗3次，置D-Hanks中，剝除結締組織和神經外膜。取得的組織剪成約1mm3大小，入0.25%胰蛋白酶及0.06%膠原酶(Collagenase)復合消化液37℃分離消化40min。加入10滴胎牛血清終止消化后，900r/min離心5min,去除上清。然后依照總論的方法在含10%胎牛血清的DMEM培養液中制成單細胞懸液，調整合適的細胞濃度接種細胞于多聚賴氨酸包被的介質上，37℃,5%CO2的孵育箱內培養3-5d。:
2.成年大、小鼠施萬細胞的獲得
取雄性2月齡鼠1只，1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉，無菌條件下切斷雙側坐骨神經遠端。7d后，分離提取20-25mm經預變性處理的坐骨神經，PBS沖洗3次，置D-Hanks中，剝除神經外膜。取得的組織剪成約1mm3大小，0.05% Collagenase-Dispase復合消化液37℃分離消化3-5h,2000r/min,離心10min,棄上清。再用含10%FCS的DMEM培養基重懸，900r/min離心5min,棄上清。最后用含10%FCS的DMEM培養基將其制成單細胞懸液，接種于經10μg/ml Laminin覆層(37°C,2h)的培養皿中。37°C,5%C02培養3-5d。
3.施萬細胞的培養
將上述兩步培養的細胞經0.125%胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，置于未覆層的培養皿中，37℃,5%CO2孵箱中培養30min后，將未貼壁的細胞懸液轉種于另－未包被的器皿中，30min后重復以上操作，最后將未貼壁細胞按照合適的密度接種在多聚賴氨酸或Laminin包被的培養器皿中。37℃,5%CO2繼續培養5-10d。培養至7d,典型的施萬細胞形態呈小卵圓形或紡錘形胞體，立體感強，伸出雙極、三極長而纖細的突起彼此交織成網絡。隨著培養時間的延長，較長的突起平行排列成束狀，胞體“肩并肩” 生長，一致性很好。
注意事項
1.不同年齡階段動物的施萬細胞培養方法迥然不同，務必根據需要選擇。
2.成功分離去除神經膜成分中的成纖維細胞是培養和純化的關鍵。由于胎鼠的坐骨神經非常細小，只有盡量剝除神經外膜，才能有效地避免原代培養中成纖維細胞的過度增長。
3.成年鼠的施萬細胞體外培養較為困難，其生長對Laminin基質有絕對依賴性，而新生鼠則在多聚賴氨酸覆層上就能很好地生長。
常見問題
1.傳統經典的差速貼壁法是一種簡便、經濟、快速有效分離和純化成年大鼠施萬細胞的方法。筆者嘗試的化學藥物抑制、免疫親和吸附法等其他方法存在藥物抑制施萬細胞活性、低產率、需要特殊儀器和耗時長等缺陷。
2.成年大鼠預變性時間最好為7-10d,否則影響細胞的產率和純度。
3.多次實驗證實預變性周圍神經中施萬細胞的增殖和活力均強于未激活神經
