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利用抗生素抗性基因篩選
發(fā)布日期:2025-03-14 13:13:31


利用抗生素抗性基因篩選


這是一種最早發(fā)展而且目前仍廣泛使用的方法。在DNA重組載體設計時已經(jīng)在質(zhì)粒中裝配了抗生素抗性基因標記,如四環(huán)素抗性基因(Tetr)、氨芐青霉素抗性基因(Ampr)、卡那霉素抗性基因(Kanr)等。當編碼有這些抗藥性基因的質(zhì)粒攜帶目的基因進入宿主細胞后,細胞就具有了相應的抗生素抗性,如果在篩選平板的培養(yǎng)基中加入有關(guān)抗生素,只有含質(zhì)粒的細胞才能生長。這種方法只能證明細胞中確實已經(jīng)有質(zhì)粒存在,但無法保證質(zhì)粒中已經(jīng)攜帶了目的基因。為了防止誤檢,人們進一步發(fā)展了采用插入缺失的方法,同一質(zhì)粒中往往有兩種抗藥性基因,在體外重組時故意將目的DNA插入到其中一個抗性基因中,使其失活,這樣得到的宿主細胞便可在含另一抗生素的培養(yǎng)基中存活,但在兩種抗生素都加入的平板上則不能生長。將這種菌株篩選出來,就能保證細胞中的重組質(zhì)粒確實已經(jīng)插入了目的基因。由于需要兩次篩選,操作比較麻煩。

例如pBR322質(zhì)粒上有兩個抗生素抗性基因,抗氨芐青霉素基因(Ampr)上有單一的 PstI位點,抗四環(huán)素基因(Tetr)上有Sal I和BamH I位點。當外源DNA片段插入到 Sal I/BamH I位點時,使抗四環(huán)素基因失活,這時含有重組體的菌株從AmprTetr變?yōu)锳mpTet8。這樣,凡是在Ampr平板上生長而在AmprTetr平板上不能生長的菌落就可能是所要的重組體。

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