水產品中氯霉素殘留量的測定——氣相色譜法（二）
7 測定步驟
7.1 樣品預處理
魚去鱗、皮，沿背脊取肌肉身；蝦去頭、殼、附肢，取可食肌肉部分；蟹、中華鱉等取可食肌肉部分；樣品切為不大于0.5cmX0.5cmX0.5cm的小塊后混勻，放置冰箱中冷凍儲存備用。
7.2 提取
將樣品解凍，稱取樣品5g（精確至0.001g），置于50mL玻璃離心管中，加入乙酸乙酯20mL，均質機均質1min，分散均勻，提取氯霉素，4000r/min離心3min，將乙酸乙酯層轉移到100mL細口雞心瓶中。再向離心管中加乙酸乙酯10mL，用原均質機均質混合1min，4000r/min離心3min，合并乙酸乙酯提取液于100mL細口雞心瓶中，于40°C水浴中減壓旋轉蒸發至干。
注：均質機清洗方法，先用大量水浸洗，再用甲醇浸洗，最后用蒸餾水浸洗。
7.3 脫脂凈化
向雞心瓶中加1mL甲醇渦旋混合溶解殘留物，再加入15mL正己烷和25mL4%氯化鈉溶液，蓋塞振蕩混合1min，充分混合提取脂肪，轉移到另一50mL離心管中，4000r/min的速度離心2min，除去上層正己烷相并棄去。再向水相中加10mL正己烷，重復提取一遍，棄去正己烷相。
水相中加入15mL乙酸乙酯，渦旋混合器混合2min，3000r/min離心3min，吸取乙酸乙酯層，經過無水硫酸鈉柱脫水過濾于50mL雞心瓶中。再向水相中加入5mL乙酸乙酯，重復上述操作。用少量乙酸乙酯淋洗無水硫酸鈉柱，合并提取液于50mL雞心瓶中，在40°C水浴中減壓旋轉蒸發至干。對于大部分樣品，到此步驟凈化效果已可達到要求，對于凈化不完全的樣品可經C18固相萃取柱進一步凈化。
加入2mL乙酸乙酯溶解提取物并轉移于5mL具塞離心管中.用1mL乙酸乙酯洗滌雞心瓶，合并乙酸乙酯，于50°C~55°C的砂浴中吹氮蒸發至近干，再用1mL乙酸乙酯洗滌離心管壁并吹干。注意防潮。
7.4 C18柱凈化
注意：以下步驟必須連續做完，切莫讓吸附劑變干。
給每個樣品準備一根C18柱，順序用5mL甲醇、5mL氯仿、5mL甲醇和5mL水淋洗活化C18柱，棄掉洗滌液。用5mL體積分數為5%的乙腈水溶液溶解7.3中在40°C水浴中減壓旋轉蒸發至干的提取物，吸取水溶液裝入C18柱過柱，棄掉流出液。注意流速保持每秒一滴，否則凈化效果和回收率都較差。用1mL水淋洗雞心瓶2遍，并將淋洗液加入C18柱過柱，棄掉流出液。用5mL水淋洗C18柱，讓洗滌液完全流出C18柱，用微氮吹干。用乙腈將08柱中的氯霉素洗脫，洗脫2次，每次1.5mL，合并洗脫液于5mL具塞離心管中。在溫度50°C~55°C的砂浴中，用氮氣吹除乙腈至近干，再用1mL乙腈洗滌離心管壁并用氮氣吹干。注意防潮。
7.5 衍生化
7.5.1 試樣的衍生化
向干的殘留物中加100μL衍生化試劑，蓋塞并渦旋混合10s，在70°C烘箱中反應30min。再在50°C?55°C砂浴中，用氮氣流吹除多余的試劑，至樣品管剛好吹干為止(注意：此步過長的吹干時間可導致丟失分析物)。加入0.5mL正己烷，渦旋混合10s，供氣相色譜分析用。
7.5.2 標準工作液的衍生化
取適量標準工作液于5mL具塞離心管中，在溫度50°C~55°C的砂浴中，用氮氣吹除溶劑至干。以下按7.5.1的步驟操作。
7.6 樣品測定
分別注入1μL適當濃度的氯霉素標準硅烷化衍生物溶液及樣品提取物硅烷化衍生物溶液于氣相色譜儀中，按上述色譜條件進行色譜分析，記錄峰面積，響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內。根據標準樣品的保留時間定性，外標法定量。
7.7 計算
樣品中氯霉素的含量按式(1)計算。
式中：
X——樣品中氯霉素含量，單位為微克每千克( μg/kg)；
cs——標準衍生物溶液相當氯霉素含量，單位為納克每毫升(ng/mL)；
A——試樣液中氯霉素衍生物的峰面積或峰髙，單位為微伏秒或毫米( μV?s或mm)；
V——樣品提取物衍生化溶液體積，單位為毫升(mL)；
As——氯霉素標準衍生物的峰面積或峰高，單位為微伏秒或毫米( μV?s或mm)；
m——樣品質量，單位為克(g)。
注：計算結果需扣除空白值。
8 方法回收率
標準添加濃度為0.1μg/kg?20.0μg/kg時，回收率≥70%。
9 方法檢測限
本方法檢測限：0.3μg/kg。
10 允許差
2次平行測定結果相對偏差≤15%。
11 方法的線性范圍
本方法的線性范圍：標準衍生物溶液相當氯霉素濃度為0.5ng/mL?250ng/mL。
文章來源：《水產品獸藥殘留限量及監測方法查詢手冊》
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