考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量
[原理]
考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質-染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。
考馬斯亮藍G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。考馬斯亮藍G-250在酸性游離狀態下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當它與蛋白質結合后變為藍色，最大光吸收在595nm。
在一定的蛋白質濃度范圍內，蛋白質-染料復合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質含量成正比，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。
蛋白質和考馬斯亮藍G-250結合，在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速，其結合物在室溫下1小時內保持穩定。蛋白質-染料復合物具有很高的消光系數，使得在測定蛋白質濃度時靈敏度很高，可測微克級蛋白質含量。
[方法與步驟]
1、標準曲線繪制
取6支試管，按下表加入各 試劑 。
管號 試劑 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
100μg/ml牛血清白蛋白溶液／mL | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸餾水／mL | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
考馬斯亮藍液／mL | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
加入考馬斯亮藍G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長下比色測定，記錄A 595 。
以各管相應標準蛋白質含量（mg）為橫坐標、A 595 為縱坐標，繪制標準曲線。
2、樣品測定
試管 中加自制蛋白質樣品1.0mL ，再加入5.0mL考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻，放置5min后，在595nm波長下比色，記錄A 595 。
根據所測A 595 從標準曲線上查得蛋白質含量。
注意事項
（1） 如果測定要求很嚴格，可以在試劑加入后的5～20min內測定光吸收，因為在這段時間內顏色是最穩定的。比色反應需在1h內完成。
（2） 測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附于 比色杯 壁上，實驗證明此復合物的吸附量是可以忽略的。測定完后可用乙醇將藍色的 比色杯 洗干凈。
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