工具酶
DNA重組技術(shù)中對核酸的“精雕細(xì)刻”主要用酶作為工具。分子生物學(xué)研究過程中發(fā)現(xiàn)的酶，許多都用作工具，表20-列出最常用的幾種工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）在重組DNA技術(shù)中有重要地位，在此較詳細(xì)介紹。
一、限制性核酸內(nèi)切酶的概念
核酸酶可分為兩類：核酸外切酶（exonuclease）是從核酸的一端開始，一個(gè)接一個(gè)把核苷酸水解下來；核酸內(nèi)切酶(endonuclease)則從核酸鏈中間水解3’，5’磷酸二酯鍵，將核酸鏈切斷。很多細(xì)菌和細(xì)胞中都能識別外來的核酸并將其分解，1962年發(fā)現(xiàn)這是因?yàn)榧?xì)菌中含有特異的核酸內(nèi)切酶,能識別特定的核酸序列而將核酸切斷;同時(shí)又伴隨有特定的核酸修飾酶,最常見的是甲基化酶,能使細(xì)胞自身核酸特定的序列上堿基甲基化,從而避免受內(nèi)切酶水解,外來核酸沒有這種特異的甲基化修飾,就會被細(xì)胞的核酸酶所水解.這樣細(xì)胞就構(gòu)成了限制一修飾體系,其功能就是保護(hù)自身的DNA,分解外來的DNA,以保護(hù)和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定,這對細(xì)菌的生存和繁衍具有重要意義。這就是限制性核酸內(nèi)切酶名稱中“限制”二字概念的由來。
二、限制性核酸內(nèi)切酶的命名
按酶的來源的屬、種名而定，取屬名的第一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的三個(gè)斜體字母作略語表示；如有株名，再加上一個(gè)字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血桿菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。
三、限制性核酸內(nèi)切酶的分類
按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系，切斷核酸的情況不同，分為三類：
Ⅰ類限制性核酸內(nèi)切酶 由3種不同亞基構(gòu)成，兼具有修飾酶活性和依賴于ATP的限制性內(nèi)切酶活性，它能識別和結(jié)合于特定的DNA序列位點(diǎn)，去隨機(jī)切斷在識別位點(diǎn)以外的DNA序列，通常在識別位點(diǎn)周圍400-700bp。這類酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。
Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶 與Ⅰ類酶相似，是多亞蛋白質(zhì)，既有內(nèi)切酶活性，又有修飾酶活性，切斷位點(diǎn)在識別序列周圍25-30bp范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)除Mg2+外，也需要ATP供給能量。
Ⅲ類限制性核酸內(nèi)切酶 只由一條肽鏈構(gòu)成，僅需Mg2+，切割DNA特異性最強(qiáng)，且就在識別位點(diǎn)范圍內(nèi)切斷DNA。是分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣的限制性內(nèi)切酶。通常在重組DNA技術(shù)提到的限制性核酸內(nèi)切酶主要指Ⅱ類酶而言。
表20-1 DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶
| 酶 | 主要用途 |
| 限制性核酸內(nèi)切酶 | 識別DNA特定序列，切斷DNA鏈 |
| DNA聚合酶Ⅰ 或其大片段（Klenow） | ①缺口平移制作標(biāo)記DNA探針 ②合成cDNA的第二鏈 ③填補(bǔ)雙鏈DNA3’凹端 ④DNA序列分析 |
| 耐熱DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等） | 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） |
| DNA連接酶 | 連接兩個(gè)DNA分子或片段 |
| 多核苷酸激酶 | 催化多核苷酸5’羥基末端磷酸化，制備末端標(biāo)記探針 |
| 末端轉(zhuǎn)移酶 | 在3’末端加入同質(zhì)多聚物尾 |
| SI核酸酶，綠豆核酸酶 | 降解單鏈DNA或RNA，使雙鏈DNA突出端變?yōu)槠蕉?/span> |
| DNA端酶Ⅰ | 降解DNA，在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機(jī)切口 |
| RNA酶A | 降解除RNA |
| 磷酸酶 | 切除核酸末端磷酸基 |
四、限制性核酸內(nèi)切酶的作用
大部分限制性核酸內(nèi)切酶識別DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)特征，切斷的雙鏈DNA都產(chǎn)生5’磷酸基和3’羥基末端。不同限制性核酸內(nèi)切酶識別和切割的特異性不同，結(jié)果有三種不同的情況：
①產(chǎn)生3’突出粘性末端（cohesive end）:以Eoor 為例：
5’…G↓AATT C…3’→5’…Gp OHTTAAC…3’
3’…C ATAA↑G…5’EooP Ⅰ 3'… CTTAAOH pG…5'
②產(chǎn)生5’突出的粘性末端：以PstⅠ為例：
5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAp OHG…3’
3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ 3’…GOH pACGTC…5
③產(chǎn)生平末端（blunt end）:Nru Ⅰ為例：
5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGp OHCGA…3’
3’…AGC↑GCT…5’Nru Ⅰ3’…AGCOh pGCT…5’
不同有限制性核酸內(nèi)切酶識別的DNA序列可以不相同。有的識別四核苷酸序列，有的識別六或八核苷酸序列。如果DNA中的核苷酸序列是隨機(jī)排列的，則一個(gè)識別四核苷酸序列的內(nèi)切酶平均每隔256bp出現(xiàn)一次該酶的識別切割位點(diǎn)，同樣的對識別六或八核苷酸序列的內(nèi)切酶則大致上分別是每隔4kb或65kb出現(xiàn)一次識別切割位點(diǎn)。按此可大致估計(jì)一個(gè)未知的DNA分子限制性內(nèi)切酶可能具有切點(diǎn)頻率，以便選用合適的內(nèi)切酶。
限制性核酸內(nèi)切酶的種類很多，至今已發(fā)現(xiàn)近800多種，可以根據(jù)它們對DNA有不同的識別序列和切割特征選用，從而為基因工程提供了有力的工具。表20-2列出了幾種最常用的限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列和切割點(diǎn)。
表20－2 幾種最常用的限制性核酸內(nèi)切酶
| 限制性核酸內(nèi)切酶名稱 | 識別序列和切割點(diǎn) |
| BamHⅠ Cla Ⅰ EooR Ⅰ Hind Ⅲ HindⅡ KpnⅠ Not Ⅰ Pst Ⅰ Sal Ⅰ Sau3A Ⅰ Sfi Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ | G↓GATCc AT↓CGAT G↓AATTC A↓AGCTT GTPy↓PuAC GGTAC↓C GC↓GGCCGC CTGCA↓G G↓TCGAC ↓GATC GGCCNNNN↓NGGCC CCC↓GGG T↓CTAGA C↓TCGAG |
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