蛋白質DNS分析法DNS—Cl(膜層析技術)
一、實驗目的
1.掌握DNS 分析法測定氨基酸的原理與方法。
2.進一步熟悉薄膜層析的操作。
二、實驗原理
熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯即DNS—Cl(Dansyl—Cl)，能與所有氨基酸的氨基結合，生成熒光物質DNS—氨基酸。DNS—Cl 也能與蛋白質或多肽的游離氨基結合，生成DNS—蛋白質或DNS—肽，經酸水解后釋放出DNS—氨基酸。
各種DNS—氨基酸與聚酰胺薄膜形成氫鍵的能力個同，即在溶劑與聚酰胺薄膜之間的分配系數不一樣，故可用聚酰胺薄膜層析分離 各種DNS—氨基酸。DNS—氨基酸在360nm 或280nm 波長的紫外光照射下，發出黃色熒光，很方便進行檢測。
蛋白質和多肽經酸水解后，肽鍵斷裂，生成游離氨基酸，所有氨基酸都能與DNS—Cl 反應。所以DNS—Cl 法可用于蛋白質或多肽氨基酸組成的微量分析。
在pH 值過高的情況下，DNS—Cl 會發生水解生成副產物DNS—NH2，DNS—OH 和DNS—Cl在紫外燈下產生藍色熒光，可以與DNS—Cl 的黃色熒光區分開來。
三、儀器、原料和試劑
儀器
層析缸、聚酰胺薄膜、電吹風、紫外燈、毛細管、真空干燥箱、具塞磨口試管、水浴鍋、水解管(硬質玻璃)等。
原料
蛋白或多肽樣品(如胰島素)
試劑
1. 各種層析純標準氨基酸
2. DNS—Cl 丙酮溶液：稱取250mgDNS—Cl 溶于100mL 丙酮中，貯于棕色瓶中，置冰箱保存，一個月內穩定
3. 三乙胺(重蒸)
4. 0.2mol/LNaHCO3溶液
5. 5.7mol/L 恒沸鹽酸
6. 展開溶液I： 88％甲酸：水＝1.5:100(V/V)
7. 展開溶液Ⅱ： 苯:冰醋酸＝9:L1(V/V)
8. 展開溶液Ⅲ： 乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸＝20:1:1(v/v/v)
9. 展開溶液Ⅳ： 0.05mol/L 磷酸三鈉溶液:乙醇＝3:l(V/V)
10. 丙酮
四、操作步驟
1.標準氨基酸的DNS 化
分別稱取2—3moL 的層析純標準氨基酸以及樣品氨基酸，溶于0.5mL0.2 mol/L 的NaHCO3溶液中。各取0.1mL 于有玻璃塞的試管中，加入0.1mLDNS—C1丙酮溶液。檢查pH，必要時用三乙胺調pH 至9.0～9.5，于室溫(20℃左右)放置2~4h，用無離子水稀釋10倍，存于暗處備用。也可用商品DNS
—氨基酸直接使用。
2.DNS—蛋白質的制備與水解
稱取0.5mg 蛋白樣品置具塞試管中，用少量蒸餾水溶解，加入0.5mL0.2 mol/L 的NaHCO3溶液，再加入0.5mLDNS—C1丙酮溶液。三乙胺調pH 至9.0～9.5，于室溫(20℃左右)放置2～4h。反應完畢，真空抽去丙酮，用5.7mol/L 恒沸鹽酸轉移至水解管，抽真空封管，110℃水解18～24hr。開管后抽去鹽酸，加少量蒸餾水，再抽干，重復2～3次除盡鹽酸，得樣品1。臨用前加幾滴丙酮，進行層析。
3.蛋白質的水解及DNS—水解氨基酸液的制備
取蛋白樣品1～2mg 于水解管，加5.7mol/L 恒沸鹽酸50μL，110℃水解18～24hr。開管后抽去鹽酸，加少量蒸餾水，再抽干，重復2～3次除盡鹽酸。向水解管內加入0.2 mol/L 的NaHCO3溶液50μL，再加入50μLDNS—C1丙酮溶液，三乙胺調pH 至9.0～9.5，于室溫(20℃左右)放置2—4h。反應完畢，真空抽去丙酮，加20μL 甲醇溶解，得樣品2，點樣層析。
4.聚酰胺薄膜的準備
將聚酰胺薄膜剪成7cm×7cm 的方塊，在距邊0.5cm 處畫互為垂直的兩條單線、交叉點為原點。若只做單向層析，則只畫一條單線，在基線上每隔1cm 畫一點樣點。
5.點樣
用微量注射器或毛細管取樣1和樣2，分別點在不同位置上，點樣直徑應小于2mm。若多次點樣，則點一次，吹干一次。
6.展開
將點好樣的聚酰胺薄膜卷成圓筒形，樣品側在筒內，箍以線圈固定。放在小層析槽內(可在小干燥器內置一培養皿代替)，槽內(培養皿)放入5～10mL 展開溶液Ⅰ進行展開，以溶劑前沿到達距頂端0.5cnm 左右為止(約20分鐘)；取出膜片，吹干。
進行雙向層析時，在第一相層析完畢且完全吹干后(有時需晾過夜，才能允分吹干)，將聚酰胺薄膜片轉90度，用展開溶液Ⅱ展開。為了區分DNS—蘇氨酸或區分DNS 天冬氨酸與DNS-谷氨酸，可在溶液Ⅱ展開后，吹干，接著用溶液Ⅲ沿同一方向展開，只需展開至一半高度即可。為了區分ε-DNS—賴氨酸、α-DNs—組氨酸與DNS—精氨酸，應在溶劑Ⅱ中展開后，吹干，接著在溶液Ⅳ中沿同一方向展開。
7.DNS—氨基酸的檢測
展開結束后，取出薄膜，用吹風機吹干，在360nm 或280 nm 的紫外光燈下檢測。DNS-氨基酸呈黃色熒光。此外還有其他顏色的雜點，如DNS—OH 顯綠色熒光等。
用樣品的層析譜與標準DNS—氨基酸層析譜相比較，樣1可鑒別蛋白樣品游離氨基酸種類，樣2可鑒別蛋白樣品的氨基酸組成種類。
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