蛋白質雙向電泳
【目的和要求】
1、 學習和掌握蛋白質雙向電泳的基本原理和方法。
2、 了解雙向電泳技術在蛋白質組 學研究中的應用。
【實驗原理】
蛋白質的雙向電泳的第一向為等電聚焦（Isoelectrofocusing,IEF）,根據蛋白質的等電點不同進行分離；第二向為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE），按亞基分子量大小進行分離。經過電荷和分子量兩次分離后，可以得到蛋白質分子的等電點和分子量信息。
等電聚焦是一種特殊的聚丙烯酰胺 凝膠電泳，其特點是在凝膠中加入一種兩性電解質載體，從而使凝膠在電場中形成連續的pH梯度。蛋白質是典型的兩性電解質分子，它在大于其等電點的pH環境中以陰離子形式向電場的正極移動，在小于其等電點的pH環境中以陽離子形式向負極移動。這種泳動只有在等于等電點的pH環境中才停止。如果在一種pH梯度的環境中將含有各種不同等電點的蛋白質混合樣品進行電泳，那么在電場作用下，不管這一群混雜的蛋白質分子原始分布如何，各蛋白質分子將按照它們各自的等電點大小在pH梯度相對應的位置進行聚集經過一定時間后，不同的蛋白質組分便分割在不同的區域之中。這個過程稱作等電聚焦蛋白質聚集的部位蛋白質所帶電荷為零，測定此部位的pH值，即可知該蛋白質的等電點。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），主要用于測定蛋白質亞基分子量，SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶劑，它能段裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。強還原劑則能使半光氨酸殘基之間的二硫鍵段裂。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，分子被解聚成它們的多肽鏈。解聚后的氨基酸側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，這就消除了不同分子之間原有電荷的差異。因此這種膠束在SDS-聚丙烯酰胺凝膠系統中的電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷的影響，而主要取決于蛋白質或亞基分子量的大小。當蛋白質的分子量在15KD到200KD之間時，電泳遷移率與分子量的對數呈線性關系。
蛋白質雙向電泳是將蛋白質等電點和分子量兩種特性結合起來進行蛋白質分離的技術，因而具有較高的分辨率和靈敏度，已成為蛋白質特別是復雜體系中的蛋白質檢測和分析的一種強有力的生化手段。
【實驗器材和試劑】
1、凝膠原液（28.38%Acr +1.62%Bis）。
2、TEMED原液。
3、過硫酸銨。
4、pH3.5～10、pH4～6、pH6～8兩性電解質載體。
5、尿素。
6、10%非離子去污劑NP-40。
7、50mmol/L NaOH；。
8、25mmol/LH3PO4 。
9、SDS。
10、60mmolTris-Cl pH6.8。
11、2-巰基乙醇。
12、10倍SDS-PAGE電極緩沖液（0.25mol/L Tris-HCl,1.92mol/L 甘氨酸，1%SDS）。
13、0.05%溴酚藍。
14、1%瓊脂。
15、蛋白質抽提液（30mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/LMgCl2,6mmol/L抗壞血酸，1%PVP，5%甘油，0.02% 2-巰基乙醇）。
16、丙酮。
17、研缽，石英砂，燒杯，試管，玻棒，量筒。
18、雙向電泳槽一套（包括圓盤電泳槽和垂直板狀電泳槽等），電泳儀。
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