超氧化物歧化酶的活性測定
超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，簡稱 SOD)廣泛存在于生物體內的含Cu、Zn、Mn、Fe的金屬類酶。它作為生物體內重要的自由基清除劑，可以清除體內多余的超氧陰離子，在防御生物體氧化損傷方面起著重要作用。離子(O 2 - )是人體氧代謝產物，它在體內過量積累會引起炎癥、腫瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧陰離子與生物體內許多疾病的發生和形成有關。由于SOD能專一消除超氧陰離子(O 2 - )而起到保護細胞的作用，SOD作為一種藥用酶，具有廣闊的應用前景，并引起了國內外醫藥界、生物界和食品界的極大關注。
按金屬輔基成分的不同可分成3種類型。最常見的一種含有銅鋅金屬輔基(CuZn-SOD)，主要存在于真核細胞的細胞質中，在高等植物的葉綠體基質、類囊體內以及線粒體膜間隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量約為3.2×10 4 ，純品呈藍綠色，每個酶分子由2個亞基通過非共價鍵的疏水基相互作用締合成二聚體。每個亞基(肽鏈)含有銅、鋅原子各一個，活性中心的核心是銅。第二種含有錳離子(Mn-SOD)，主要存在于真核細胞的線粒體和原核細胞中，在植物的葉綠體基質和類囊體膜上也有存在，純品呈粉紅色，由4條或2條肽鏈組成。第三種是Fe-S0D，過去一直認為只存在于原核細胞中，近來發現有一些真核藻類甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD純品呈黃色或黃褐色，由2條肽鏈組成，多數情況下每一個二聚體中含有一個Fe原子。
[原理]
SOD的活力測定方法很多，常見的有化學法、免疫法和等電點聚焦法。其中化學法應用最普遍，化學法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會產生有色中間物和O2 -，利用SOD分解而間接推算酶活力。在化學方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學發光法，腎上腺素法，NBT-還原法，光化學擴增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡單易行較為實用。化學發光法和光化學擴增法不適用于測定Mn-SOD，但對于Cu/Zn-SOD反應極靈敏。Cyte還原法用于Mn-SOD活力測定結果穩定，重復性好。但專一性和靈敏度不夠理想，而且需要特殊 儀器 ，實際應用受到限制。亞硝酸鹽形成法與CN—抑制劑或SDS處理相結合，應用于Mn-SOD測定，靈敏度比Cyte還原法提高數倍，而且專一性強，重復性好，操作方便，不需要特殊 儀器 和設備，易于實際應用和推廣，是目前較好的測定方法之一。
在一般情況下，SOD酶活性測定只能應用間接活性測定法。本實驗采用鄰苯三酚自氧化方法。
鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O 2 - ，生成帶色的中間產物，反應開始后反應液先變成黃棕色，幾分鐘后轉綠，幾小時后又轉變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結果。這里測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留30～45s后，與時間成線性關系，一般線性時間維持在4min的范圍內，中間物在420nm波長出有強烈光吸收。當有SOD存在時，由于它能催化O 2 - 與H+結合生成O 2 和H 2 O 2 ，從而阻止了中間產物的積累，因此，通過計算即可求出SOD的酶活性。
酶活力單位定義：在25℃恒溫條件下，每毫升反應液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達50%的酶量定義為1個酶活力單位。
[ 試劑 和器材]
1、 試劑
（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
稱取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用雙蒸水溶解至80mL左右，用HCl調節pH =8.20（用pH計校正），最后定容至100mL。
（2）10mmol/L HCl
（3）50 mmol/L鄰苯三酚
稱取鄰苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
（4）SOD樣液
2、器材
（1）恒溫水浴槽
（2）紫外分光光度計
（3） 試管 、刻度吸管、微量注射器
[方法和步驟]
1、鄰苯三酚自氧化速率的測定
取兩支 試管 按下表加入25℃預熱過的緩沖液,然后加入預熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚 ），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長處測定光吸收值，每隔30s讀數一次，測定4min內每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.07（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。
試劑 | 空白管（mL） | 自氧化管（mL） |
pH8.2、50mmol/L | 2.98 | 2.98 |
10mmol/L HCl | 0.02 | 0.01 |
50 mmol/L鄰苯三酚 | - | 0.01 |
2、SOD樣液的活性測定
樣品管取代自氧化管。樣品管測定時先加入預熱的待測酶液，再加鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測定。
試劑 | 空白管（mL） | 樣品管（mL） |
pH8.2、50mmol/L | 2.98 | 2.98 |
10mmol/L HCl | 0.02 | - |
SOD樣液 | - | 0.01 |
50 mmol/L鄰苯三酚 | - | 0.01 |
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