親和層析法純化胰蛋白酶粗液的方法步驟
解析蛋白酶活性測定 聚焦蛋白酶研究新進展
一、實驗目的
1.熟悉親和層析 純化蛋白質的的原理。
2.初步掌握親和層析 法純化胰蛋白酶的方法步驟。
二、實驗原理
親和層析已經廣泛應用于生物分子的分離和純化，如結合蛋白、酶、抑制劑、抗原 、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸及多糖類等，也可用于分離細胞、細胞器、病毒等。近十多年來，親和層析發展十分迅速，尤其是對那些分離流程長、難度大、濃度低、雜質多，采用常規方法難以進行分離的生物分子來說，親和層析顯示出其獨特的優越性。
親和層析主要是根據生物分子與特定的固相化配基之間的親和力而使生物分子得到分離。它是由吸附層析衍生、發展起來的分離技術。利用親和層析載體 固相化配基與親和互補物之間通過范德華力、疏水力、靜電力、氫鍵作用等發生專一性的結合而進行分離。這種有選擇性地結合主要歸結于固相化配基與親和互補物二者之間的生物學特性和特異的化學結構以及空間構象。在親和層析過程中，被純化的生物分子在一定的條件下，選擇性地結合到被共價偶聯到不溶性載體上的配基上，然后改變原有的條件，如洗脫液的PH 值、離子強度、有機溶劑的濃度等，有選擇性地從載體上把被分離物洗脫下來。通過親和層析法分離的物質，其純度、活性回收率及純化倍數均較高。
親和層析的載體 要選用機械強度高、非特異性吸附少、水不溶性的、具有較多化學反應基團—羥基的多糖類介質，該載體在溫和條件下與配基共價偶聯，而又不影響配基及被分離物質原有的生物學特性。
1967年Porath 和Ernback 報道了采用溴化氰可將含有氨基的有機分子偶聯到多糖基上，使得親和層析技術向前推進了一大步。直到目前，溴化氰活化載體還是用得最多，效果最好的活化方法。1971年Porath 又報道了應用環氧氯丙烷在堿性條件下活化載體的方法，克服溴化氰由于劇毒給操作帶來的不便，使活化載體的方法簡便易行，親和層析技術得到廣泛的應用。
目前可用于活化載體的活化劑有幾十種之多，但常用的是溴化氰、環氧氯丙烷、1.4—丁二醚、戌二醛等。采用環氧氯丙烷為活化劑，sepharose 4B 為載體，雞卵類粘蛋白為配基可合成適用于分離胰蛋白酶的親和吸附
劑。載體活化及偶聯反應如下：
1. 環氧氯丙烷活化載體與配基偶聯
2. 溴化氰活化載體與配基偶聯
上述反應，除了氨基能偶聯外，也能與巰基發生偶聯反應。
另一種與配基的偶聯方式是插入”手臂”。在親和層析中如果要以一個小分子作為配基(如胺類)，而被分離物(親相互補物)又是一個大分子，二者在結合過程中就會受到空間阻礙，影響結合效果。因此，必須在載體和配基之間引入一段”手臂”，即再接上一段有機分子，使載體上的配基向外擴展伸長以增強配基和互補物之間的接觸面，減少空間位阻，提高親和層析的結合效率。合成過程要經過載體活化，接” 臀”、活化及連接配基等操作步驟。
目前常用的載體是瓊脂糖膠粒。它具有機械強度高、透性好、載體本身非特異性吸附少等優點。除此以外，其他可用作載體的材料還有纖維素、葡聚糖凝膠(SePhadex)、多孔硅膠、樹脂等。但是它們都具有不同程度的非特異性吸附，因此目前使用的并不多。
本實驗采用豬胰蛋白酶的天然抑制劑—雞卵類粘蛋白作為配基.從豬胰臟的粗提液中分離純化胰蛋白酶。雞卵類粘蛋白是一種專一性很強的胰蛋白酶的抑制劑，對豬和牛的膠蛋白酶有很強的抑制作用。而對胰凝乳蛋白酶無抑制作用。在pH7.6~8.0的范圍內，豬或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在雞卵類粘蛋白上，在 PH2.5~3.0的范圍內，能從雞卵類粘蛋白上被洗脫下來。因此，采用雞卵類粘蛋白作為配基合成親和吸附劑，可以從豬胰臟的粗提液中，通過親和層析直接獲得純度很高的豬胰蛋白酶。比活力可以達1.5~2.0×104BAEE 單位/mg 酶蛋白，相當5次重結晶的胰蛋白酶，純化效率可提高10-20倍以上。
三、儀器、原料和試劑
器材：
紫外分光光度計、核酸蛋白質檢測儀、高速組織搗碎機、恒溫水浴搖床、L 層析柱(10mm×100mm)、G—3玻璃燒結漏斗、酸度計、抽濾瓶。
原料
新鮮豬胰臟
試劑
1. 環氧氯丙烷，1，4—二氧六環，乙烯，乙腈，溴化氰
2. 5mol/L 硫酸;
3. 5.0mol/L 氫氯化鈉
4. 0.2mol/LpH9.5碳酸鈉緩沖液。
5. 親和柱平衡液：0.5mol/L 氯化鉀—0.05mol/L 氯化鈣-0.1mol/L，pH7.8 tris-HCl 緩沖液;
6. 親和柱洗脫液：0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5混合液;
7. pH2.5~3.0乙酸酸化水。
8. Sepharose 4B ，雞卵類枯蛋白，純胰蛋白酶。
四、操作步驟
(一) 載體—SePharose4B 的活化
1.環氧氯丙烷活化法：
取適量的sepharose 4B，于G—3玻璃燒結漏斗(簡稱G—3漏斗)上抽去保護液。稱10g(濕重)Sepharose 4B，用100mL0.5mol/L 氯化鈉溶液淋洗，除去56Pha rose 4S 凝膠內的保護劑，用蒸餾水洗凈，轉移到100mL 的錐形瓶內。然后加入6.5mL 2.0moL/L 氫氧比鈉溶液、1.5mL 環氧氯丙烷、15mL 56%1，4二氧六環，于45℃的恒溫水浴搖床內振蕩活化2小時。然后將活化的凝膠轉移到G3漏斗內抽干，用蒸餾水洗至pH8.0左右，再用20mL 0.1mol/L，pH9.5碳酸鈉緩沖液淋洗。處理完畢后立即偶聯。
2.溴化氰活化法：
稱取10g Sepharose 4B(濕重)，凝膠處理方法與1相同，把SePharose 4B 凝膠轉移到一個100mL 的燒杯中(以下操作步驟必須在通風櫥內進行)。加入15mL 0.2mol/LpH10.0的碳酸鈉緩沖液，然后將燒杯放置冰浴中，用電磁攪拌器慢慢攪拌。戴上膠皮手套，小心稱取3g 溴化氰，加入3mL 乙腈將溴化氰溶解。
取一支滴管向燒杯內滴加溴化氰使它與Sepharose 4B 反應，同時取另一支滴管向燒杯內滴加6mol/L 的氫氧化鈉.使反應體系的pH 值保持在pH10.0左右(在酸度計上校正)，待溴化氰加完以后繼續攪拌，反應5分鐘。此時反應體系的pH 值不再下降，仍維持在pH10.0左右，停止反應。迅速轉移到G3漏斗內抽濾，抽濾瓶內應預先加入一定量的固體硫酸亞鐵，以破壞濾液中未反應的溴化氰。用 200mL 預冷的蒸餾水淋洗，最后浸泡在20mL 0.1mol/LpH9.5，碳酸鈉緩沖液中，處理完成后立即偶聯。
3.配基—雞卵類粘蛋白的偶聯：
將已經活化處理好的Sepharose 4B 轉移到一個50mL 的錐形瓶內。然后取I0mL0.1mol/L，pH 9.5的碳酸鈉緩沖液將約150mg 的雞卵類粘蛋白溶解，取出0.1mL 蛋白溶液稀釋30倍，在紫外分光光度儀上測定A280。根據消光系數A=4.13計算出偶聯前的蛋白含量。再將9.9mL 蛋白溶液加入到盛有活化Sepharose 4B 的三角瓶內，混勻，在40-45℃的恒溫水浴搖床內振蕩偶聯20-24小時左右，終止偶聯。
將凝膠轉移到G3漏斗內，用100mL 0.5mol/L 的氯化鈉溶液抽濁、淋洗，以除去未被偶聯的雞卵類粘蛋白。取一個干凈的抽濾瓶收集濾波，測定濾液A280，計算出末被偶聯蛋白的量，然后用100mL的蒸餾水洗，用50mL 0.1mol/L 甲酸-0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5甲酸混合液洗，最后用蒸餾水洗至約pH6.5即可。將凝膠轉移至50mL小燒杯內，用30mL 0.5mol/L氯化鉀—0.05mol/L氯化鈣0.1mol/L、pH7.8Tris—HCL 緩沖液浸泡20分鐘。脫氣后裝柱或置4℃冰箱保存。
(二) 胰蛋白酶粗操液的制備
取50g 豬新鮮胰臟(除去脂肪和結締組織)剪碎置于高速組織搗碎機內，加入200mL預冷的pH2.5~3.0的乙酸酸化水，勻漿。于10℃提取4小時以上，4層紗布過濾，收集濾液并用5mol/L 的氫氧化鈉調至PH8.0，加入終濃度為0.1mol/L 氯化鈣及1~2mg 胰蛋白酶晶種，置4℃激活12~16小時或在室溫(25℃左右)激活2~4小時。待胰蛋白酪比活達到1000~1500 BAEE 單位/mg 以后，用6mol/L 硫酸調至pH3.0停止激活。
放置4℃冰箱內備用。測定胰蛋白酶活性。
(三)親和層析純化胰蛋白酶
取一支層析柱(10mm×100mm)，裝入少量親和柱平衡液(0.5mol/L 氯化鉀—0.05mol/L 氯化鈣0.1mol/L，pH7.8 Tris—HCl 緩沖液)，將親和吸附劑一次裝入柱內，待親和吸附劑自然沉降至約1/2總體積后，調節合適的流速。用親和柱平衡液平衡。用核酸蛋白質檢測儀檢測流出液.待基線達到穩定后即可。
取一定體積的蛋白酶粗提液(30-50mL，視酶液的蛋白濃度及比活而定)調至pH8.0.用濾紙過濾，取濾液上柱吸附，然后用親和柱平衡液平衡。用核酸蛋白質檢測儀檢測流出液，待基線達到穩定后改用親和柱洗脫液(0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5混合液)洗脫。收集洗脫峰2，測定酶蛋白含量及活性，
層析圖譜，如圖3—9。
圖3—9 親和層析純化胰蛋白酶洗脫曲線
平衡液：0.5mol/L 氯化鉀，0.05mol/L 氯化鈣，0.1mol/L，pH7.8Tris-HCl 緩沖液。
洗脫液：0.1mol/L 甲酸，0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5混合液。
(四) 胰蛋白酶的保存
經親和層析分離得到的胰蛋白酶，一般是比較純的酶，但是酶蛋白的濃度往往很低。通常可用pH5.0的乙酸透析除去溶液中的無機鹽，然后冰凍干燥成粉末，長期保存。也可將酶溶液放在-20℃的冰箱冰凍保存或者在4℃，pH3.0的酸性溶液中保存，可保存兩年左右。
北京天優福康生物科技有限公司
官網：http://m.jyzjsd.com/
服務熱線：400-860-6160
聯系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
