多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( PCR) 基因擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測
一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理，掌握PCR的基本操作技術(shù)以及瓊脂 糖凝膠電泳技術(shù)。
二、 實(shí)驗(yàn)原理
PCR 用于擴(kuò)增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)段，即通過引物延伸而進(jìn)行的重復(fù)雙向DNA合成。基本原理及過程如下：
PCR循環(huán)過程中有三種不同的事件發(fā)生：（1）模板變性；（2）引物退火；（3）熱穩(wěn)定DNA聚合酶 進(jìn)行DNA合成。
1． 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94-95℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。
2． 退火：在體系溫度降至37-65℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)合，使引物與模板鏈3’端結(jié)合，形成部分雙鏈DNA，即退火階段。
3． 延伸：體系反應(yīng)溫度升至中溫72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA，即引物的延伸階段。
上述3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25～30個循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106～109倍。
典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、兩條合成的DNA引物、耐熱DNA Taq聚合酶。
瓊脂糖凝膠電泳的原理：瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45℃開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍以上，且熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測到5 ng以上的DNA。
三、實(shí)驗(yàn)材料及相關(guān)試劑
基因組DNA，基因特異性引物，PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑，等
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1．模板DNA的抽提：實(shí)驗(yàn)一所得的水稻基因組DNA。
2．PCR操作 (在冰上操作)：
（1）PCR反應(yīng)混合液的配制：反應(yīng)體系25 μL, 在無菌的0.2 mL離心管中按下列操作程序加樣：
（2）將反應(yīng)混合液混勻, 然后每個PCR管中分裝24 μL反應(yīng)混合液，再加1 μL模板DNA，最后加1滴石蠟油，防止水分蒸發(fā), 然后稍離心。
（3）將PCR管放到PCR熱循環(huán)儀中，按下列程序開始循環(huán)：
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