Edman降解的具體步驟
Edman降解是蛋白質測序中一個非常重要的反應步驟，因為通過該反應可以對蛋白質有序的氨基酸組成進行分析。自動化Edman測序儀現在已得到廣泛使用，他們能夠對長約50個氨基酸的肽進行測序。以下概括了使用Edman降解進行蛋白質測序的步驟，隨后還將對其中一些重要步驟做詳細說明。
1. 用2-巰基乙醇等還原劑破壞蛋白質中的任意二硫鍵，過程中可能需要一個保護基團（例如碘乙酸）以防止化學鍵重新形成；
2. 果蛋白質不止一個，則需要分離并純化蛋白質混合物中的各條肽鏈；
3. 確定每條鏈中的氨基酸組成；
4. 確定每條鏈末端的氨基酸；
5. 將每條鏈斷裂成50個氨基酸以下的片段；
6. 分離并純化肽片段；
7. 確定每個肽片段的序列；
8. 使用其他裂解方式重復以上步驟；
9. 構建整條蛋白質序列。
Edman測序實驗流程圖（來源：百泰派克）
蛋白質裂解成肽片段的過程
長度超過50-70個氨基酸的肽不能通過Edman降解來進行蛋白質測序。因此，需要將長蛋白鏈裂解成小片段，然后再進行單獨測序。裂解過程可以通過內肽酶（例如胰蛋白酶或胃蛋白酶）進行，也可以通過化學試劑（例如溴化氰）進行。不同的酶具有不同的切割模式，片段之間的重疊可用于構建整體蛋白質序列。
Edman反應過程
將待測序的蛋白質吸附到固體表面上。常見的一種基材是涂有聚丁二烯(一種陽離子聚合物)的玻璃纖維。將Edman試劑苯基異硫氰酸酯（PITC）與12％三甲胺的弱堿性緩沖溶液一起添加到吸附的蛋白質中，將所得物與氨基酸N端的胺基進行反應。
然后通過添加無水酸來選擇性地分離末端氨基酸。接著，該衍生物異構化，得到替代物苯基硫代乙內酰脲。洗掉該替代物并通過色譜法鑒定，重復整個循環。每個步驟的效率約為98％，能有效地鑒定約50個氨基酸。
蛋白質測序儀的使用
蛋白質測序儀是一種以自動化方式執行Edman降解的機器。將蛋白質或肽的樣品固定在蛋白質測序儀的反應容器中，進行Edman降解。每個循環從蛋白質或肽的N端釋放并衍生一個氨基酸，然后通過HPLC鑒定生成的氨基酸衍生物。對整個多肽重復進行測序過程，直到測定了完整的可測量序列或提前設定的循環次數為止。
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