雙鏈cDNA末端補平
1. 在第二鏈反應(yīng)體系中,順序加入下列試劑(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微離心混勻反應(yīng)物, 37℃反應(yīng)至少30分鐘,然后75℃滅活10分鐘;
3. 加入等體積酚/氯仿/異戊醇,劇烈振蕩后,常溫下13000g離心5分鐘;
4. 離心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等體積氯仿,上下顛倒幾次混勻后,常溫下13000g離心5分鐘;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V預(yù)冷的無水乙醇,混勻,-20℃放置過夜以沉淀雙鏈cDNA;
6. 第二日,將昨日沉淀物在4℃,13000g離心60分鐘以充分沉淀雙鏈cDNA;
7.離心完畢,棄上清,加入1ml 70%乙醇洗滌沉淀,常溫下13000g離心5分鐘;
8.離心完畢,棄上清,干燥沉淀至無乙醇氣味.
注：第3，第4步可以用PCR 純化試劑盒代替。
PCR純化試劑盒操作流程：
1．溶液PE使用前應(yīng)加入適量體積95％－100％的乙醇，混勻。
2．向200ul二鏈補平產(chǎn)物中加入5倍體積的buffer PB，混勻。
3．加入spin column中，13000rpm離心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm離心1min。
5．13000rpm，再離心1min。
6．將spin column放入一新的離心管中，加入50ul buffer EB，靜置10min。
7．13000rpm離心2min。
8．加入30ul buffer EB，靜置10min。
9．13000rpm離心2min。
10．加入1/10體積3M的NaAc，2.5倍體積無水乙醇，混勻，－20℃沉淀過夜。
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