豬肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)

1、細(xì)胞培養(yǎng)所用溶液及其配制

1×RPMI1640及：按照產(chǎn)品說明配制，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

新生牛血清：56℃滅活30min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

2×104U/ml青、鏈霉素液（雙抗）：青鏈霉素各2×106 U溶于100ml滅菌雙蒸水中，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

10×Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%）：Na2EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g ，Na2HPO4.12H2O 2.89g，KH2PO4 0.2g，1%酚紅溶液1.5ml，胰酶（1:250）2.5g，溶于100ml雙蒸水中，NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2~7.5，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)1∶10倍稀釋。

7.5%NaHCO3： 7.5g NaHCO3溶于100ml雙蒸水中，115℃高壓滅菌15min，置4℃冰箱冷藏備用。

10% RPMI1640營養(yǎng)液：于1×RPMI1640溶液中加入10%小牛血清，按照1% 比例加入2×104U/ml雙抗，用7.5% NaHCO3或10% HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2~7.4。

2、將50日齡的SPF仔豬放血，結(jié)扎氣管后無菌摘取其肺臟，先用0.9%的生理鹽水洗滌外表面，將pH7.2的PBS30.0ml從氣管灌入肺臟，輕輕拍打肺表面，1~2min后回收灌洗液，如此反復(fù)進(jìn)行，直至灌洗液清亮為止。

將回收的支氣管肺泡灌洗液用吸管輕輕吹打，將細(xì)胞團(tuán)塊打散，用單層無菌100目不銹鋼篩過濾，收集全部灌洗液，2000r/min離心10min，收集沉淀。洗滌兩次后加入適量含10%胎牛血清的1×RPMI1640營養(yǎng)液吹散細(xì)胞，置培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中于37?C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁后棄去上清及非黏附細(xì)胞繼續(xù)用含10%胎牛血清的1×RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)備用。

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