貼壁細胞消化方法總結
一、酶消化法
1、胰酶。這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25%的胰酶作用于單層貼壁的細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鐘就足夠了。終止是用血清。主要作用于細胞間。配制時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存于-20度。
2、膠原酶。這種方法比較少，一般是用原代培養時，從組織消化下細胞。這種方法作用溫和，對細胞損傷較小，但是，價格也較貴。中止同樣是用血清。
二、離子螯合劑
不破壞細胞表面分子，僅與CAMs螯合，因此，如果檢測細胞表面分子的話，盡量，甚至是一定不要用酶消化法。
1、EDTA。用得也是非常多。一般濃度在0.02%左右。作用于細胞與間質，對細胞間也有一定作用。注意，它能顯著影響pH值，而且在弱堿性條件下才易溶。因此，配制時應調節好酸堿度。它不能被終和。因此，消化下來的細胞要洗一遍。
2、商品化的無酶消化液。個人的使用經常覺得對細胞的損傷比較大，但是分離成單細胞懸液的能力確實比較強。
三、物理法
直接吹打或用細胞刮子將細胞刮下來。
四、冷凍法
此方法僅能用于細胞傳代時。無法使組織上的細胞脫落下來。本方法的原理，我想是因細胞冷凍后收縮，從而從培養瓶上脫落下來。優點是：對細胞損傷小，不需要中止或洗細胞，方便，不需要另外配制消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊，又特別嬌氣的細胞。
不足是細胞常成小片脫落。此種方法曾用于因用其它方法傳代導致大量細胞死亡操作的間充質干細胞、DC細胞的培養，效果非常滿意。具體過程是：1、用較多的4度的PBS洗滌一遍細胞(以6孔板為例，加1.5ml/孔)，2、再加0.5ml 4度的PBS，靜置操作臺上，很快細胞就小片脫落，3、輕輕吹打，細胞即完全脫落，4、按一定比例傳代。
細胞消化難題：
1，先用PBS把細胞洗兩遍，使瓶內沒有血清了，減少對胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在細胞有些消化下來時，拿著瓶口，運用手腕的力量輕輕震蕩瓶內液體，這樣細胞很快就下來了，還不需要吹打，分散也均勻。
2，成團、絮狀：
消化液里加入edta可以減少細胞成團的現象，血清可以終止胰酶的作用，如果是進口血清的話也能終止edta的作用。用胰酶消化后胰酶可以倒掉，也可以不倒，直接加血清終止，如果消化液中加入了edta的話，就要將消化液倒干凈，如果細胞貼壁要求不是很嚴格的話，一般不需要進行離心
鼻咽癌細胞。這種細胞的貼壁能力很強，用0.5%胰酶（含0.1%EDTA）一般要消化12~15min。
用PBS洗滌時要洗凈殘余的培養基，加入胰酶后在培養箱中消化（避免細胞室溫下受損以及在此溫度時胰酶活性最強）至細胞收縮變圓（可顯微鏡下觀察）且有少許細胞脫落（有流下來的趨勢），隨后立即棄去胰酶（如果脫落的細胞很多且需要大量細胞實驗，則不能棄去胰酶），加入培養基仔細吹打（不能用無血清培養基或者PBS替代，否則細胞聚集成團塊或絮狀）。一般我都離心一次棄去上清（去除殘留的胰酶及漂浮的死細胞或細胞碎片）。
消化過度
馬上用培養基中和，用吸管吹打細胞，收集全部的細胞到以無菌的離心管中800RPM 3分鐘。棄上清，用全培重懸，換新的培養瓶繼續培養。狀態不好的細胞在培養的過程中會死亡脫落，在換液的時候可以清除掉。
貼壁細胞消化傳代時通常采用兩種方法：
一、加入胰酶等細胞脫落后，再加培養基中止胰酶作用，離心傳代；二、加入胰酶后，鏡下觀察待細胞始脫落時，棄胰酶，加培養液分瓶。但前者太麻煩，而后者有可能對細胞施加胰酶選擇，因為總是貼壁不牢的細胞先脫落，對腫瘤細胞來說，這部分細胞有可能是惡性程度較高的細胞亞群。
一種簡單的消化傳代方法。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30s），棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據細胞消化的難易程度），棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將細胞消化單細胞。
對于較難消化的細胞，可以用2%利多卡因消化5-8分鐘，然后再棄去，加培養基吹打也可以，對細胞的影響不大。
不用PBS也不用Hanks洗，只要把舊培養液吸的干凈一點，直接加酶消化應該不會有什么問題。
棄培養液后，用0.04%的EDTA沖洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室溫孵育5min，棄取大部分EDTA，加入與剩余EDTA等量的胰酶（預熱）總體積1/10v。消化到有細胞脫落。不過有人說EDTA對細胞不好，有證據嗎？
培養的BASMC：倒掉舊培養液加入少量胰酶沖一下，倒掉再加入0.125-0.25%胰酶約6-10滴或1ml（25ml bottle）消化再加入適量新培養基中和，并分瓶這種方法簡單、省事；效果很好并且不損失細胞！
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