心肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

器械：

飯盒、燒杯、彎頭解剖剪（2）、小鑷子（2）、平皿（4）、毛玻片、濾網(wǎng)、離心管（15ml）、移液管、培養(yǎng)瓶、廢液缸、PE手套、橡膠手套、冰盒

溶液：

PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶

動(dòng)物：

小鼠

準(zhǔn)備：

用酒精棉球擦拭臺(tái)面后把物品擺放好，開紫外線燈照30分鐘后開鼓風(fēng)機(jī)吹至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，提前半小時(shí)將培養(yǎng)液、胰酶37℃溫浴。

培養(yǎng)過程：

1、兩個(gè)圓皿中加入5ml的PBS培養(yǎng)液，將小鼠浸入70％酒精<5min，用小剪子及小鑷子開胸取心。

2、取出的心放在一個(gè)裝有PBS的平皿中，剔除心臟周邊的血凝及纖維組織。

3、PBS再?zèng)_洗后，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)預(yù)先裝好5ml胰酶的平皿中，用剪子將平皿中的心臟剪成1mm3的碎塊，倒入15ml離心管中，加入3-5ml胰酶沖洗平皿轉(zhuǎn)移到離心管中。

4、放入水浴鍋中，溫和搖動(dòng)，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血紅細(xì)胞、細(xì)胞碎屑和死細(xì)胞。

5、再將8-10ml胰酶加入盛有組織的離心管，吸管輕輕吹打1min，消化10min，小心轉(zhuǎn)移上清+2ml DMEM至另一離心管中，細(xì)胞懸液離心，1000轉(zhuǎn)×10min，棄上清，加培養(yǎng)基為管1。

6、重復(fù)第5步，3-8次，直至至組織塊消化為止。

7、將多次細(xì)胞懸液經(jīng)100目濾網(wǎng)過濾，混合。

8、加入1ml DMEM重懸，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

9、培養(yǎng)1-1.5小時(shí)，收集培養(yǎng)液中的非貼壁細(xì)胞，小心不要晃動(dòng)。

10、顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)至5×105-6×105細(xì)胞/ml。

11、4-6小時(shí)后，用培養(yǎng)基輕輕沖洗2次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)孵育過夜。

或從第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37℃水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培養(yǎng)基終止。

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