正常小鼠前脂肪細胞的培養

實驗材料：

1. 細胞來源：8—12天齡的小鼠；

2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.4；

3. 消化液：0.3%膠原酶溶液，含4%牛血清白蛋白。用Hanks液配制；

4. DW培養液：DMEM和WAJC404培養液按1：1（V/V）混合，添加100IU/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素；

5. 培養液a：DW培養液，10%胎牛血清；

6. 培養液b：DW培養液，補充胰島素10μg/ml、轉鐵蛋白10μg/ml、成纖維細胞生長因子（FGF）10ng/ml和高密度脂蛋白（HDL）溶液5μl/ml；

7. 高密度脂蛋白（HDL）溶液：含蛋白質18mg/ml和膽固醇10mg/ml；

8. 地塞米松：工作濃度為10-7 mol/L；

9. 篩網：孔徑分別為250μm與80μm的尼龍網篩；

實驗方法：

1. 取材；

① 取8—12天齡的小鼠，窒息處死后，置于冰塊上；

② 在無菌條件下迅速切取腹股溝的脂肪墊，放入PBS液中；

③ 清除脂肪墊中的大血管和結締組織，洗凈血污。稱取脂肪墊的重量；

2. 分離細胞；

① 將脂肪墊剪成1mm3 左右的小塊，轉入50ml錐形離心管中；

② 每0.1g組織塊加入3—4ml消化液。在37℃水浴搖床上以60r/min的轉速輕微振蕩，消化1h。其間每隔10min取出離心管，搖動，使組織塊與消化液充分混勻；

③ 消化完后，用吸管反復吹打消化液，分散組織塊，制成細胞懸液；

④ 用孔徑為250μm的尼龍網篩過濾細胞懸液，除去未分散的組織塊，收集濾液。將濾過液再用孔徑為80μm的尼龍網篩過濾，除去大部分成熟脂肪細胞，收集濾液；

⑤ 將最后得到的濾液離心（700g，7—10min）。吸棄漂浮的脂肪細胞和消化液；

⑥ 用培養液a清洗細胞，離心（700g，7min）。將細胞團制成懸液，再離心。最后，將細胞沉淀用培養液a重新制成細胞懸液。

3. 原代培養；

① 用培養液a調節細胞密度。將細胞以1.5×104個/cm2 的密度接種于培養板中；

② 24h后，用DW培養液徹底清洗細胞，除去培養物中殘留的胎牛血清和未貼壁的細胞（主要為紅細胞）；

③ 換入培養液b，在37℃、5%CO2 培養箱中培養。以后用培養液b維持培養。每3d換液一次；

④ 在細胞匯合成片后，繼續培養；或于細胞匯合成片后第五天，在培養液b中加入10-7 mol/L地塞米松，繼續培養；

⑤ 培養至出現漂浮細胞時，即可收貨細胞，進行鑒定。

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