單克隆抗體細胞融合實驗操作步驟及注意事項

• 生物幫之抗體制備

(一)融合劑

細胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學融合法和生物融合法，如仙臺病毒，此處例舉化學融合法中的一種即聚乙二醇融合法。

聚乙二醇(PEG)，在分子 量為200～700時，呈無色、無臭的粘稠狀液體，分子量大于1 000時，呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，與許多化學藥品不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4 000者，常用濃度為50%，pH8.0～pH8.2(用10%NaHCO3調整)，分子量小的PEG，融合效應差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。50%濃度，pH偏堿時融合效應最高。

也有采用30%～50%濃度的PEG加上10%二甲亞砜。

不同批號的PEG，即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時必須注意。每批都必須進行細胞毒性試驗后方可應用。要買高純度的，一般選供氣相色譜 用的PEG。

(二)融合過程

融合的方法很多，常用的有轉動法和離心法。

融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。

1.試劑與材料

(1) 供融合用的脾細胞及骨髓瘤細胞。

(2) 1640培養(yǎng)液100ml。

(3) 完全1640液100ml。

(4) 2.5%FCS-1640液50ml。

(5) HAT培養(yǎng)液100ml。

(6) 50%PEG：取分子量4 000，高純度的(日本進口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌，使用前用預熱于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合，以酚紅檢查pH，一般不必調pH。如pH有改變，可用HCl或NaHCO3調整。

(7) 10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。

(8) 40孔塑料培養(yǎng)盤。

2.操作方法

⑴ 準備好脾細胞。

⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾細胞和107小鼠骨髓瘤細胞，并加入50ml 2.5%FCS-1640液。

⑶ 室溫400g離心3min，使細胞沉淀。

⑷ 移去上清液。

⑸ 輕敲管底部，使沉淀流動，把沉淀管放于40℃水浴中，使其達融合溫度。

⑹ 加預熱至40℃的50%PEG 0.8ml，用1ml吸管緩慢滴加，邊加邊搖沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現(xiàn)，滴加過程要求持續(xù)2min。

⑺ 加1ml1640液，邊加邊搖動，持續(xù)1min。

⑻重復⑺一次。

⑼ 加1ml 1640液，邊加邊搖動，持續(xù)0.5min。

⑽ 重復⑼一次。

⑾ 加1640液15ml。

⑿ 室溫，400g離心1min，使細胞沉淀。

⒀去上清，輕敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。

⒁ 往已于前一日種有飼養(yǎng)細胞的40孔塑料培養(yǎng)盤中滴加融合的細胞液，每孔1滴(約0.05ml)。

⒂ 輕搖后，放入5%CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。

⒃ 第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養(yǎng)液。注意輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細胞吸出，根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細胞。

⒄ 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培養(yǎng)液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細胞生長出來。大多數(shù)雜交瘤細胞在10~20天內出現(xiàn)，但也有在1個月左右才能出現(xiàn)的。雜交瘤細胞出現(xiàn)后，吸取上清液，檢查抗體。

⒅ 對繼續(xù)生長的雜交瘤細胞進行增殖傳代。在傳代過程中，依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS-1640液。同時保存于液氮和進行克隆 化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產生抗體細胞的變異和丟失。

(三)細胞融合的關鍵

1.技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。

2.融合試驗最大的失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個干凈的環(huán)境，以及適宜的無菌操作技術。