大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選
一、實(shí)驗原理
在以微生物為材料的遺傳學(xué)研究中,用某些物理因素或化學(xué)因素處理細(xì)菌 ,使基因發(fā)生突變,喪失合成某一物質(zhì)(如氨基酸、維生素、核苷酸等)的能力,因而它們不能在基本培養(yǎng)基上生長,必須補(bǔ)充某些物質(zhì)才能生長。這樣從野生型經(jīng)誘變篩選得到的菌株,稱為營養(yǎng)缺陷型。篩選營養(yǎng)缺陷型菌株必須經(jīng)過以下幾個步驟:誘變處理、淘汰野生型、檢出缺陷型、鑒定缺陷型。由于本實(shí)驗是以大腸桿菌為材料,所以根據(jù)細(xì)菌的特性分別說明篩選的步驟。
誘變劑的作用主要是提高突變頻率,它分為物理和化學(xué)的二類。物理誘變劑常用的有X射線、紫外線、快中子、γ射線等誘變處理首先是選擇誘變劑,微生物 誘變中最常用的物理誘變劑是紫外線。
誘變劑所處理的微生物,一般要求呈單核的單細(xì)胞或單孢子的懸浮液,分布均勻,這樣可以避免出現(xiàn)不純的菌落。用于誘變處理的微生物一般處于對數(shù)生長期,那時的細(xì)菌對誘變劑的反應(yīng)最靈敏。
誘變處理必須選擇合適的劑量,劑量的表示有二種,絕對劑量和相對劑量。絕對劑量的單位以爾格/cm2表示,一般用相對劑量。相對劑量與三個因素有關(guān),這三個因素是:誘變源和處理微生物的距離,誘變源(紫外燈)的功率,以及處理的時間。前二個因素是固定的,所以通過處理時間控制誘變劑量。各種微生物的處理最適劑量是不同的,須經(jīng)預(yù)備實(shí)驗確定。
經(jīng)處理以后的細(xì)菌,缺陷型還是相當(dāng)少的,必須設(shè)法淘汰野生型細(xì)胞,提高營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所占比例,以達(dá)到濃縮缺陷型的目的。細(xì)菌中常用的濃縮法是青霉素法。青霉素是殺菌劑,它只殺死生長的細(xì)胞,對不生長的細(xì)胞沒有致死作用。所以在含有青霉素的基本培養(yǎng)基中野生型能長而被殺死,缺陷型不能長被保存得以濃縮。
檢出缺陷型的方法有逐個測定法、夾層培養(yǎng)法、限量補(bǔ)給法、影印培養(yǎng)法。這里主要以逐個測定法為例進(jìn)行說明。把經(jīng)過濃縮的缺陷型菌液接種在完全培養(yǎng)基上,待長出菌落后將每一菌落分別接種在基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上。凡是在基本培養(yǎng)基上不能生長而在完全培養(yǎng)基上能長的菌落就是營養(yǎng)缺陷型。
經(jīng)初步確定為營養(yǎng)缺陷型的菌用生長譜法鑒定。在同一培養(yǎng)皿上測定一個缺陷型對多種化合物的需要情況。
二、實(shí)驗材料
大腸桿菌 K12的野生型菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)K12SF+。
三、實(shí)驗器具和藥品
1.用具:滅菌培養(yǎng)皿(9厘米),滅菌三角燒瓶(150毫升),滅菌吸管(1.5毫升),滅菌離心管。
2.培養(yǎng)基:
(1)肉湯液體培養(yǎng)基:牛肉膏0.5克,蛋白胨1克,NaCl0.5克,蒸餾水100毫升,pH7.2,高壓滅菌15磅/英寸215分鐘。
(2)肉湯液體培養(yǎng)基(ZE):牛肉膏0.5克,蛋白胨1克,NaCl0.5克,蒸餾水50毫升,pH7.2,高壓滅菌15磅/英寸215分鐘。
(3)基本液體培養(yǎng)基:Vogel50×2毫升,葡萄糖2克,蒸餾水98毫升,pH7.0,高壓滅菌8磅/英寸230分鐘。