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人溶菌酶的藥理作用及在畢赤酵母表達系統中的表達研究
發布日期:2023-09-13 08:59:58


人溶菌酶的藥理作用及在畢赤酵母表達系統中的表達研究


人溶菌酶是一種重要的非特異性體液免疫因子,對于人體而言是不可或缺的,藥理研究表明其具有抗菌消炎、抗病毒和增強免疫力等功能。人溶菌酶在人體內分布雖然廣,然而難以獲取,因此人溶菌酶的廣泛應用只能寄希望于采用DNA重組技術,利用酵母表達或真核表達系統進行大規模生產人溶菌酶。

人溶菌酶是人體本來就存在的一種蛋白質,作為藥物使用不會對人體產生任何不良反應和副作用,即使長期使用也不會產生耐藥性,一些生物公司提供的蛋白表達服務可以高效表達人溶菌酶。畢赤酵母表達系統是一種能夠高效表達重組蛋白的系統,一方面由于畢赤酵母屬于真核生物,因此畢赤酵母表達出來的蛋白可以進行糖基化修飾,另一方面畢赤酵母生長速度快,可以將表達的蛋白分泌到培養基中,方便蛋白純化。隨著人溶菌酶研究的深入,相信終有一天會開發出具有重要臨床價值的藥物。

1、人溶菌酶的藥理作用

(1)抗菌消炎

眾所周知,肽聚糖是革蘭氏陽性菌細胞壁的一種重要成分。人溶菌酶可水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺中的B-1,4糖苷鍵,在滲透壓作用下導致革蘭氏陽性菌細胞壁破裂,發生溶菌作用。在體內環境下,由于有分泌型免疫球蛋白A、補體參與,人溶菌酶還能水解某些革蘭氏陰性菌,如大腸桿菌等。由于真菌細胞壁中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺之間形成的B-1,4糖苷鍵(幾丁質)也是人溶菌酶作用的底物,所以人溶菌酶可以抗含有幾丁質細胞壁的真菌感染。人溶菌酶還能與各種誘發炎癥的酸性物質結合,使其失活,并增強抗生素和其他藥物的療效,改善組織基質的粘多糖代謝,從而有利于修復被炎癥損傷的組織。

(2)抗病毒

人溶菌酶是一種堿性蛋白質,在體內近于中性的pH環境下帶有大量正電荷,可與帶負電荷的病毒蛋白起作用,和DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽,使侵入體內的病毒失活。

(3)增強免疫力

溶菌酶參與機體內多種免疫反應,在機體正常防御和非特異性免疫中具有重要作用。它可改善和增強巨噬細胞吞噬消化功能,降低細胞抑制劑導致的白細胞減少,結合細菌脂多糖,減輕內毒素作用,以達到增強機體抵抗力的目的。

(4)激活血小板

人溶菌酶能激活血小板,改善組織局部循環障礙,分解膿液,增強局部防衛,從而更好地體現抗菌、消炎、止疼等作用。

2、人溶菌酶在畢赤酵母表達系統的表達研究

(1)將α信號肽和人溶菌酶(hLYZ)基因作為整體進行密碼子優化,并將其插入pPICZαA空載體,構建重組表達載體pPICZ-OptαF+hLYZ。通過轉化篩選,獲得一株穩定性較好的重

在5 L發酵罐中培養K1,細胞密度達到50 g-DCW?L-1開始誘導,甲醇濃度控制于5 g?L-1,最終的總蛋白濃度為1.71 g?L-1,總酶活達到262,152 U?mL-1。

(2)對α信號肽做了進一步的優化處理,新插入39個堿基,構成包含增長的信號肽和人溶菌酶(hLYZ)基因的新序列將其插入pPICZαA空載體,構建得到另一表達載體pPICZ-EhnαF+hLYZ,通過轉化篩選獲得重組子K4。K4搖瓶表達發酵液總蛋白濃度為320 mg?L-1,總酶活為16,974 U?mL-1,均優于K1。在5 L發酵罐中采用與K1相同的誘導策略,最終發酵液中的總蛋白濃度可達到2.54 g?L-1,比K1提高48.5%,但總酶活為258,712 U?mL-1,比 K1 略低。

(3)考察了 K4在高細胞密度(~100 g-DCW?L-1)下起始誘導的hLYZ表達性能。進行純甲醇誘導,并將甲醇濃度控制于5 g?L-1,誘導54 h發酵液中的總蛋白濃度為3.02 g?L-1,但隨后發生嚴重降解,誘導68 h后僅剩2.07 g?L-1。采用甲醇/山梨醇共混流加策略,優先將甲醇濃度控制于5 g?L-1,不控制溶解氧濃度,誘導68 h總蛋白濃度可達到2.88 g?L-1,未出現明顯的蛋白降解現象。上述二種誘導策略下最高的總酶活水平分別為324,072 U?mL-1 和 290,438 U?mL-1。

(4)利用Bgl Ⅱ和BamH Ⅰ屬于同尾酶的特點,設計多拷貝串聯hLYZ基因表達載體,并獲得了兩拷貝及四拷貝串聯hLYZ基因轉化重組子K-2-2、K-4-2。搖瓶發酵條件下,K-2-2和K-4-2的最高總蛋白濃度分別為193.0mg?L-1和185.3 mg?L-1,對應的總酶活分別為5,256 U?mL-1和5,424 U?mL-1。5 L發酵罐中,K-2-2低細胞密度(~50 g-DCW?L-1)誘導73 h及高細胞密度(~100 g-DCW?L-1)誘導65 h后,發酵液中的總蛋白濃度分別為0.79 g?L-1和0.93 g?L-1,總酶活分別為70,332 U?mL-1和71,529 U?mL-1,約為重組子K1的50%。K-4-2誘導表達10 h后細胞失去活性,發酵失敗。多拷貝串聯hLYZ基因轉化重組子的溶菌酶表達性能較低。

目前重組人溶菌酶的大規模生產還存在這樣或那樣的問題,但重組DNA技術發展日新月異,相信在不久的將來,會有高效表達的工程菌或工程細胞問世。美迪西生物醫藥在重組蛋白表達與純化服務方面經驗豐富,其擁有多種蛋白表達系統,包括原核蛋白表達系統、酵母蛋白表達系統、昆蟲細胞蛋白表達系統(桿狀病毒)哺乳動物細胞蛋白表達系統,具備多種融合技術,可以為客戶在蛋白表達與純化方面提供多種選擇。從方案設計、基因優化、表達條件優化到純化的技術體系,以提高客戶的目的蛋白表達水平。

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