干細胞實驗技術入門
《Science》剛剛公布的十大科學突破中，占據首位就是細胞重新編程技術(iPS，induced pluripotent stem cells)，這一才初初“面世”一年的干細胞 技術引發了生命科學研究領域的極大震動，引用《科學》雜志負責新聞的副主編Robert Coontz的話就是“這項研究幾乎在一夜之間開啟了一個生物學的新的領域，它有希望成就醫學上挽救生命的進展。”
由于這一技術的迅速發展，涌現了許多“干細胞技術新手”，但是對于如何培養這些細胞，以及誘導細胞分化，初接觸這一技術的研究人員常常感到束手無策，即使花了很多時間還是抓不準這些細胞的特性，無論是研究人類胚胎干細胞hESCs，還是人類iPS 細胞hiPSCs，都需要花費大量的時間重復鋪板，來保證這些細胞自然分化。
來自薩克生物研究學院(the Salk Institute for Biological Studies)干細胞中心的主任Travis Berggren建議，對于新接觸干細胞研究的實驗人員來說，在收到第一批冷凍細胞的時候，要拋開所有之前有關哺乳動物細胞培養 的概念，因為許多標準細胞培養的技巧方法也許并不適用于干細胞，而且由于多能性有關的細胞機制至今了解的并不多，因此要想知道在未分化狀態，哪些培養物和材料能最好的誘導細胞，甚至進行特征描述，這些都可能非常困難。除此之外，要確保培養物不被細菌感染，注意要不斷的對加入的試劑進行檢測。
1.了解細胞
來自加拿大多倫多大學的Peter Zandstra實驗室的一項研究項目就是：通過從單層細胞懸浮液中收集人類胚胎干細胞hESCs，提高hESC分化的一致性和產量。
人類胚胎干細胞hESCs和人類誘導多功能干細胞hiPSCs的分化需要細胞聚集，但是細胞團中的細胞常常大小和形狀不一，從而導致不同步分化。為了能解決一致性的問題，Zandstra實驗室的博士后Mark Ungrin嘗試利用一些公開的實驗指導手冊獲取單細胞懸浮液聚集體，剛開始的時候，他能得到穩定的聚集細胞，但是之后這些細胞就紛紛死了，他回憶道，“不同實驗中細胞的大小都不一致，有時我在一個孔里能發現幾種聚集細胞。”
Ungrin花了6個月的時間鉆研細胞培養基，之后，他開始轉向細胞本身，結果發現了兩個重要的因素：一個是他驚訝的發現，經過幾代傳代的成熟的hESCs一般都會形成穩定的細胞聚集，而在分化前階段的細胞則傾向于形成單細胞懸浮，因此Ungrin決定在細胞分化之前收集細胞。另外一個發現就是一種Rho關聯的激酶，這種小分子抑制劑在之前的研究中發現能提高細胞存活率，Ungrin發現對于他的干細胞，這種小分子也起作用。
Ungrin表示，“進行人類胚胎干細胞研究最令人頭疼的事之一，就是你在實驗室中做的工作很難重復，而你又不知道是什么原因”，即使是用不同的移液器進行平板轉移，也有可能造成不同的結果。因此Ungrin建議研究人員除了記住培養基，還要記住自己細胞的年齡階段和狀態，這些都會影響存活率。
干細胞培養確實是頗令人煩惱的一項實驗過程，這是許多剛進行干細胞研究的實驗人員所沒有意料到的，不過通過越來越多積累的實戰經驗也許能漸漸悟出其中的前因后果，不過也可以利用一些商品化的產品幫助我們盡快的解決這些問題。
針對干細胞培養，著名的細胞培養產品公司HyClone(屬于Thermo Scientific)推出了AdvanceSTEM系列產品，這一系列產品主要支持小鼠干細胞研究的各種應用，包括細胞擴增，保持小鼠胚胎干細胞和人成體間質干細胞的未分化狀態，將間質干細胞專一的分化成神經元，脂肪細胞，軟骨細胞和骨細胞等類型的細胞等等。
其中AdvanceSTEM?推薦的DMEM是一款低滲DMEM，這款產品具備一般常規細胞培養的影響因素(生長因子等)，重要的是具有與小鼠胚胎干細胞相近的最佳滲透壓，而且其特異的配方保證在37℃5%CO2的培養條件下能夠保持生理狀態下的pH，這些對干細胞生長和保持一致性非常有好處，另外可以在這個DMEM中加入AdvanceSTEM?血清替代物，幫助使胚胎干細胞保持在未分化的狀態，AdvanceSTEM?血清替代物是一種無血清培養物，血清是動物細胞離體培養常見的培養液，在某些情況下不能用血清培養細胞，比如觀察一種生長因子對某種細胞的作用。
另外Invitrogen公司在今年5月就推出了首個間充質干細胞的無血清培養基，專門用于間充質干細胞(MSC)或來源于骨髓的干細胞的培養。STEMPRO MSC SFM是完全限定的，意味著培養基中的每一種成分都是已知量的，因而排除了顯著的批間差。這個培養基能使MSC維持未分化狀態超過9代，而用傳統的加血清培養基培養的細胞在5代后就開始出現分化。此外，Invitrogen還推出了一種完全限定的無動物來源的干細胞基質，用于胚胎、間充質和神經干細胞的附著和擴增。(其中STEMPRO MSC SFM入圍了本年度十大創新產品評比的候選名單，歡迎大家投票)
2.尋找標記
來自維吉尼亞共和國大學在干細胞生物工程學家Raj Rao希望能利用細胞表面標記物了解人類胚胎干細胞，進而調控胚胎干細胞，但是目前對于評估hESCs的多能性，以及胚胎干細胞在分化的時候會產生什么樣的變化，并沒有設定標準。通常采用的細胞標記包括階段特異性胚胎抗原3和抗原4(SSEA-3和SSEA-4)，但是不同的細胞系在SSEA-3和SSEA-4的表達上差別較大，很難統一。
為了解決這個問題，Rao利用了一種在胚胎發育過程中結合和修飾細胞表面糖組分的蛋白：凝集素lection。小鼠ESC有關的文獻表明，在發育的植入前和植入階段，凝集素受體會展示在細胞表面。Rao研究小組對14種不同的凝集素進行了分析，希望能找到與SSEA-4同時表達的凝集素，結果他們發現了一些這種蛋白，比如蓖麻凝聚素(Ricinus communis agglutinin)，懷槐凝集素(Maackia amurensis)，這些蛋白可以緊緊的結合在hESCs上，能用于預測多能性。
Rao表示，你實驗的標記越多，那么就越能證明細胞的多能性。對于希望進行凝集素檢測實驗的研究人員而言，這種方法相對直接和便宜，需要的只是一些抗體，和一臺臺式的流式細胞儀。
但是要記住，對于不同的細胞系，甚至是同一細胞系的不同細胞群，凝集素和其它細胞表面標記物，比如SSEA-4的表達都是不相同的，要想增加結果的可信度，可行的一個辦法就是增加分析樣品的數目。
其中Rao提到的這兩種抗體，默克，Invitrogen等廠家可以提供，至于臺式流式細胞儀，可以考慮下占市場較大份額的公司：美國的BD(Becton Dickinson)公司和貝克曼Beckman Coulter公司(原名稱Couter)。
BD的流式細胞儀，不消說，是經典中的經典，其生產的產品都冠以FACs(fluorescence-activated cell sorter)熒光激活細胞分選儀的名稱——FACs即流式細胞儀的縮寫，這不僅說明了BD生產流式細胞儀的時間早，也說明了其流式細胞儀的品質高，近期國內進行的重組桿狀病毒的研究就是利用的他家的流式細胞儀。BD的流式細胞儀產品型號比較齊全，包括FACSCount(小型流式細胞儀)、FACSCAlibur(流式細胞儀)、FACSAria(流式細胞分選儀)、FACSVantage SE(多色分析和高速分選流式細胞儀)、LSRII(數字化分析型流式細胞儀)。這些流式細胞儀各有各的特點，比如FACSAria流式細胞分選儀這種臺式高速細胞分選儀的出現大大提高了分選性能，同時還增強了其它功能(具體可見2008技術點評：流式細胞分選)。
近期BD還推出了首款干細胞分選試劑盒，這種即用型的多能干細胞鑒定和分選試劑盒包括了預滴定的熒光標記抗體，實驗設定磁珠、驗證過的實驗步驟以及軟件分析模板。此試劑盒針對現有的BD流式細胞儀優化過，開箱即用。即使經驗不多的流式細胞儀用戶，也能快速掌握這種方法。它同時將分析與分析之間的變異性減至最低，讓結果更快更可靠。在抗體用完之后，能輕松補充抗體，滿足特別的研究需求。
另外Beckman Coulter推出的適合篩選量大的實驗室的流式細胞儀，可以用于生物醫學基礎研究以及臨床檢測的許多領域，如遺傳、腫瘤、血液、免疫等諸多研究中紅細胞、T細胞、淋巴細胞亞群測定、檢測早期細胞凋亡、腫瘤細胞免疫測定等。
除了這兩個大品牌，也可以考慮其它流式細胞儀，比如Accuri Cytometers、Guava科技公司、Union Biometrica、Amnis等，近期Guava科技公司與Millipore公司宣布將會獎勵給一名科學家一臺Guava的流式細胞儀，價值10萬美元，條件是這名科學家的創新研究計劃將會推動對細胞生物學的了解。申請時間為2009年的1月1日到4月30日，在Millipore和Guava的網站上都可提交(www.millipore.com 和www.guavatechnologies.com)。有興趣的國內科學家可以試一下。
3.防止污染
薩克生物研究學院(the Salk Institute for Biological Studies)的Travis Berggren研究小組通過成纖維細胞飼養層研究hESC自我更新調控。但是05年Berggren在WiCell研究院進行研究的時候，許多實驗室的細胞被支原體污染，這種污染物具有抵抗抗生素的能力，并且不容易觀察到。
研究小組花了兩個星期的時間清洗細胞和培養物，滅菌消毒，但是他們浪費的不只是兩個星期的工作時間，由于支原體生長很慢，并且不會干擾分化，因此研究人員長達一個月的時間都不知道所研究的細胞已經被污染，即使在發現了污染物后，一些合作研究人員即使檢測到了污染，仍然認為他們的細胞能存活，Berggren說，“這告訴我們，實際上早就應該進行檢測了。”
因此Berggren的研究小組建立了一個常規檢測過程，在其后的三年里他們都嚴格執行著這一步驟，每個星期他們都會通過支原體特異性酶或DNA檢查新培養物，每2-4個星期檢查舊培養物。所有新的培養物質，比如用在飼養層的小鼠成纖維細胞，都會先經過檢查，并且在使用培養物之前，他們都會至少驗證兩次。
對于將小鼠ESCs的研究轉向人類ESCs研究的實驗室而言，支原體特別的麻煩，這是因為人類干細胞在操作上更難，它們更易失去分化潛力，或者死亡。進行hiPSCs研究的實驗室也需要注意這個污染問題。
對于這種情況首先需要的是預防，確保細胞來源和培養物沒有受到支原體的感染，再來就是需要及時的發現支原體感染，檢測支原體的方法有很多，包括肉眼觀測方法，PCR方法，熒光檢測方法，電鏡檢測方法等，其中比較常見的是PCR方法和熒光檢測方法，前者譬如Sigma-Aldrich，Stratagene等公司都有相關的試劑盒，后者用的比較多的是Hoechst公司的相關產品，具體可見支原體細胞培養中的大敵。
4.干細胞分化
美國ATCC干細胞中心的華人科學家馬武(Wu Ma，音譯)研究組在細胞外基質ECM對于干細胞自我更新和分化十分關鍵的這一理論的基礎上，希望能了解ECM中有哪些元素對于干細胞形成神經祖細胞具有決定作用。
他們檢測了兩個不同的hESCs系，將這兩個細胞系鋪在五種不同的基質表面：多聚賴氨酸(poly-D-Lysine)，纖維粘連蛋白(fibronectin),人層連蛋白(laminin),I型膠原蛋白(type 1 collagen)，以及Matrigel(BD公司的一種ECM)，結果他們發現laminin上培養的細胞是分化得最好的，研究人員也發現這種效果也與干細胞整合素受體有關，因為阻斷a6b1受體會減緩分化。
雖然馬博士發現了最適合于他的基質，但是這并沒有給出一個“包治百病”的“藥方”：同一培養機制對于不同的細胞系具有不同的效果，因此馬博士建議，在選擇培養物和其它介質的時候，不僅要了解過去的干細胞研究的微環境如何，還要仔細看看正常體內發育過程中所涉及的細胞因子。比如說要分化成神經細胞，那么就可以看看哪些是大腦發育過程中常見的因子，不過也要注意這也是有局限性的，一些人類胚胎干細胞系在同樣的培養條件下也會產生多少不一的神經細胞。
Tips：
1.參加培訓
由于干細胞實驗操作相對而言還是一門比較新的學問，因此如果允許的話，可以考慮參加一些培訓，比如在去年的美國國立衛生研究院NIH的預算中，有一項(T15)就是針對人類胚胎干細胞培養和維持進行培訓，NIH的干細胞特別小組(Stem Cell Task Force)仍然在討論這個項目。國內的也有類似的培養班，比如中科院生化所的人類誘導的多能干細胞(iPS細胞)技術高級培訓班等。另外一個方法就是尋找一些機會和在這方面操作熟練的人學習，或者進入其它實驗室進行學習和實際操作。
2.首先檢測對照
來自Invitrogen公司的干細胞專家Mahendra Rao推薦兩種便宜，又能來源方便的細胞系：BG01V和NT-2(N tera-2)，前者是一種核型異常的ESC細胞系，后者是一種胚胎癌細胞系，這兩種細胞系都可以從ATCC獲得，利用這兩種細胞可以檢測培養物：如果選擇的培養介質會導致這兩種細胞死亡，那么實驗的ES細胞也存活不了。
3.不要隨意改變
一旦獲得一個細胞系，就要按照指導嚴格的操作，不要隨意改變培養條件，當保存了冷凍細胞株之后，才能根據實驗需要改變培養條件。
4.仔細閱讀
如果你不是一個“熟手”，那么最好還是仔細研究下近期相關的研究成果，實驗指導，和細胞的特性，一本值得推薦的書是Human Embryonic Stem Cell Protocols(Kursad Turksen)和Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide(Jeanne Loring)。
5.常規檢測
早期要建立一些質量控制的常規檢測，包括監測培養箱中的溫度，濕度，二氧化碳水平等等，另外正如上面所述的，定時檢測細胞是否被污染也十分的重要。
