動物細胞大規模培養技術
一、前言
動物細胞培養開始于本世紀初1962年，動物細胞培養規模開始擴大，發展至今已成為生物、醫學研究和應用中廣泛采用的技術方法，利用動物細胞培養生產具有重要醫用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，動物細胞培養已成為醫藥生物高技術產業的重要部分。利用動物細胞培養技術生產的生物制品已占世界生物高技術產品市場份額的50%。動物細胞大規模培養技術是生物技術制藥中非常重要的環節。目前，動物細胞有懸浮培養和貼壁培養.技術水平的提高主要集中在培養規模的進一步擴大、優化細胞培養環境、改變細胞特性、提高產品的產率與保證其質量上。
二、動物細胞的特點及生長特性
動物細胞雖可像微生物細胞一樣，在人工控制條件的生物反應器中進行大規模培養，但其細胞結構和培養特性與微生物細胞相比，有顯著差別：
①動物細胞比微生物細胞大得多，無細胞壁，機械強度低，對剪切力敏感，適應環境能力差；
②倍增時間長，生長緩慢，易受微生物污染，培養時須用抗生素；
③培養過程需氧量少(氧傳質系數KLa 大于10 h-1即可滿足每毫升107個細胞的生長)；
④培養過程中細胞相互粘連以集群形式存在；⑤原代培養細胞一般繁殖50 代即退化死亡；⑥代謝產物具有生物活性，生產成本高，但附加值也高。
三、動物細胞的固定化培養技術
1、固定化培養方法
在動物細胞培養中，培養細胞的目的不僅僅要求催化活細胞培養中，培養細胞的目的不僅僅要求催化活力，更重要的是利用細胞來合成和分泌蛋白，因此如何保持細胞的活性顯得尤為重要。由于動物細胞的極度敏感性，上述這些固定化方法會對動物細胞產生毒性，另外多糖(如卡拉膠等) 由于具有很高的離子強度也會對細胞產生毒害，故在動物細胞培養中要考慮使用較溫和的固定化方法，如吸附、包埋、中空纖維或膠囊化。
（1）吸附
①多孔陶瓷
美國某公司開發了一種完全自動化的細胞培養系統，該系統的核心是陶質矩形蜂窩狀生物反應器。反應器構型是一圓筒內裝置有許多陶質矩形通道的蜂窩狀圓柱體，可提供4. 25 m2 的生長表面積，既可用于培養懸浮生長的細胞，又可用于培養貼壁依賴性細胞。該系統可以連續化生產蛋白質。由于產物直接分泌到培養基中，給分離純化帶來方便。而且細胞不用從培養基中分離，所以不必考慮梯度問題；當培養基高速循環時，可以保持相對恒定的營養物和氧濃度。增加套數即可實現放大。
②微載體
微載體細胞培養法是一種用于培養錨地依賴性細胞的大規模培養技術。這種培養技術是在生物反應器內加入培養液和一種對細胞無毒害作用的材料支撐的顆粒 (微載體) ，使細胞在微載體表面附著和生長，并通過不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態。培養液中大量的微載體為細胞提供了極大的附著表面，1g微載體其比表面積可達 6000cm2，從而可實現細胞的高密度培養。
微載體的直徑在60～250μm ，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由這些材料及其改良型制成的微載體主要參考了細胞的粘附特性，在其表面帶有大量電荷及其他生長基質物質，因而有利于細胞的粘附、鋪展和增殖。采用微載體培養具有以下優點： ①比表面積大，單位體積培養液的細胞產率高；②采用均勻懸浮養，無營養物或產物梯度；③可用簡單顯微鏡觀察微載體表面的生長情況；④細胞收獲過程相對簡單，勞動強度?。虎菖囵B基利用率高，占地面積??；⑥放大容易，國外已有公司以1 000 L 規模培養人的二倍體細胞來生產β- 干擾素。但其缺點是攪拌槳及微珠間的碰撞易損傷細胞；接種密度高；微載體吸附力弱，不適合培養懸浮型細胞。
③大孔微載體
人們為了解決微載體培養系統中細胞易受機械損傷的缺陷以及能最大限度地擴大比表面積，開發了具有完全連通溝回的大孔微載體。
大孔微載體將細胞固定在孔內生長，因而與其他方法相比具有一系列優點： ①比表面積大，是實心微載體的幾倍甚至幾十倍；②細胞在孔內生長，受到保護，剪切損傷??；③與包埋法相比，傳質尤其是傳氧效果好；④兩種類型細胞都適用；⑤細胞三維生長，細胞密度是實心微載體10倍以上，有的可108個/ mL；⑥適用于長期維持培養，細胞生長情況依然良好；⑦微載體濃度高，實心載體在培養液中濃度增大到一定時，細胞密度反而下降；而大孔微載體在濃度較高時，表面碰撞增加，能促使細胞在孔內生長；⑧最適合于蛋白質生產和產物分泌。因此有人預言，大孔微載體質生產和產物分泌。因此有人預言，大孔微載體技術將成為動物細胞大規模培養的一種常用方式。
（2）包埋
將動物細胞包埋在各種多聚物多孔載體中而制成固定化動物細胞的方法稱為包埋法。此法步驟簡便，條件溫和，負荷量大，細胞泄露少。因細胞嵌入在高聚物網格中而受到保護，細胞能抗機械剪切。但該法也有一定缺點，如擴散限制，并非所有細胞都處于最佳營養物濃度。包埋法一般適用于非錨地依賴型細胞的固定化。多孔凝膠是最常用的載體，用于動物細胞固定化的凝膠主要有海藻酸鈣、瓊脂糖、血纖維蛋白等。
①海藻酸鈣凝膠
海藻酸鈣凝膠包埋法是將動物細胞與一定量的海藻酸鈉溶液混合均勻，然后滴到一定濃度的氯化鈣溶液中形成直徑約1mm內含動物細胞的海藻酸鈣膠珠，分離洗滌后即可用于培養。此法操作時條件溫和，對活細胞損傷小。但固定后機械強度不高。為了大量制備海藻酸鈣凝膠包埋的固定化細胞，國外已有專門的振動噴嘴設備可供使用。
②瓊脂糖凝膠
瓊脂糖凝膠可用二相法制得。將含有細胞的瓊脂糖溶液分散到一個水不溶相中(如石蠟油) ，形成直徑0.2mm凝膠珠珠，移去石蠟油后，細胞即可進行培養。同海藻鈣一樣，瓊脂糖更適于培養懸浮細胞。盡管凝膠珠形成過程很復雜，目前放大體積不超過20 L。但瓊脂糖凝膠無毒性，具有較大的空隙，可以允許大分子物質自由擴散，因此該法特別適用于蛋白產物的連續生產。有人曾用瓊脂糖包埋雜交瘤細胞和淋巴細胞生產單克隆抗體和白細胞介素。
③血纖維蛋白
將動物細胞與血纖維蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉化為不溶性的血纖維蛋白，將動物細胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進細胞貼壁，因此兩種類型的細胞都適于培養。而且基質高度多孔，允許大分子物質的自由擴散。但機械強度差，對剪切力很敏感。
（3）中空纖維
中空纖維細胞培養技術是模擬細胞在體內生長的三維狀態，利用一種人工的“毛細管”即中空纖維給培養的細胞提供物質代謝條件而建立的一種體外培養系統。
中空纖維培養技術的優點是無剪切、高傳質、營養成分的選擇性滲入，使培養細胞和產物密度都可達到比較高的水平。缺點是膜的污染和堵塞，觀察困難，細胞生長或過量氣體產生會破壞纖維。中空纖維培養技術的發展趨勢是讓細胞在管束外空間生長，以達到更高的細胞培養密度。目前中空纖維反應器已進入工業化生產，主要用于培養雜交瘤細胞來生產單克隆抗體。
（4）微囊化
微囊化培養技術其要點是：在無菌條件下將擬培養的細胞、生物活性物質及生長介質共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養系統內進行培養。生長介質為1.4%海藻酸鈉溶液，半透膜由多聚賴氨酸形成。培養系統可采用攪拌式或氣升式反應器系統。實驗證明，采用批式和連續灌注式培養雜交瘤細胞生產單克隆抗體，在7～27 d微囊內抗體濃度可達1250～5300 mg/ L。利用微囊包裹具有特定功能的組織細胞，形成免疫隔離的人工細胞，以此植入疾病動物或病人體內。1980 年報道了微囊化胰島移植治療大量實驗性糖尿病。他們將同種大鼠胰島用海藻酸- 聚賴氨酸- 聚乙烯亞胺包埋后植入鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠體內，在未用免疫抑制劑的情況下，控制大鼠血糖正常達一年左右。
膠囊化培養的優點是：
①可防止細胞在培養過程中受到物理損傷；
②活性蛋白不能從囊中自由出入半透膜，從而提高細胞密度和產物含量，并方便分離純化處理。
缺點是： ①微囊制作復雜，成功率不高；②微囊內死亡的細胞會污染正常產物；③收集產物必須破壁，不能實現生產連續化。
2、固定化方法的選擇
(1) 培養規模
由于各種固定化系統可以獲得相同的細胞密度，且細胞的產率主要取決于細胞的擴散，因此反應器的體積是培養規模放大的主要決定因素。雖然微載體系統可以提供最大的單元操作，但其他系統也可以通過增加單元套數而獲得放大。
(2) 培養方式
除了海藻酸鈣包埋法外，其他固定化基質都是多孔型的，能允許大分子物質自由出入，因此可實現蛋白質產物的連續生產。在凝膠珠和微囊中可使蛋白產物積聚到很高的濃度，給后續的分離純化處理帶來方便，并大大降低了生產成本。
(3) 所培養的細胞類型
大多數固定化系統都適用于貼壁型細胞的培養。而在吸附非貼壁型細胞時，由于吸附力弱容易出現細胞泄露。
(4) 制備方法的難易和成本
由于固定化基質是由制造商在不同的競爭時期提供的，因此各種固定化方法的成本很難比較。海藻酸鹽和瓊脂糖是以化學試劑形式出售；膠原珠是以無菌形式提供給使用者，以便于接種。
3、固定化培養存在的問題
(1) 固定化細胞培養的細胞密度較一般懸浮培養高10～100 倍，但同時也帶來了如何保證足夠的營養物質和氧的傳遞問題。
(2) 細胞群體在大規模、長時間培養過程中分泌產物能力的丟失或產物活性的降低依然是細胞培養領域深感棘手的問題。包埋在凝膠或微囊中死亡的細胞會對其他細胞產生污染和毒害作用。
(3) 培養基及固定化基質價格昂貴，生產成本高居不下。尤其是高效的微載體細胞培養介質，銷售價格一直呈上漲趨勢。
(4) 目前對細胞代謝和生長動力學的研究以及在線監測水平還遠不足以設計出確定的優化培養系統，從而導致昂貴培養基的浪費。
4、固定化動物細胞培養的展望
固定化動物細胞培養工程發展的總方向是大型化、自動化、精巧化、低成本、高細胞密度、高目的產品產量。從國際上的發展趨勢看，動物細胞培養技術主要有：（1）開發細胞培養反應器和培養系統；(2) 開發培養貼壁細胞的載體；(3) 開發微囊技術；(4) 開發雜交、重組技術；(5) 開發無血清和化學合成的培養基；(6) 蛋白質濃縮和提純技術。
四、動物細胞的灌注培養技術
動物細胞培養同傳統的微生物細胞培養相比，動物細胞培養存在著細胞倍增時間長、代謝途徑復雜、對營養的要求高、對外界環境如溫度、pH、溶氧、滲透壓、剪切力的敏感性強、細胞狀態容易改變等問題，大大增加了動物細胞培養的難度。如何完善細胞培養技術，提高動物細胞大規模培養的產率，一直是國內外研究的熱點之一。
1、灌注培養原理
常用的動物細胞培養方法有分批培養、補料分批培養、連續培養，但產率一直不高。直到六十年代，灌注培養技術的出現，為動物細胞高密度大規模培養開辟了廣闊的前景。在隨后的三十年中，灌注培養技術得到了迅速地發展，已成為動物細胞大規模培養的主要方法。
在灌注培養中，細胞保留在反應器系統中，收獲培養液的同時不斷地加入新鮮的培養基。灌注培養的主要優點是連續灌注的培養基可以提供充分的營養成分，并可帶走代謝產物，同時，細胞保留在反應器系統中，可以達到很高的細胞密度。同其他方法相比，灌注培養的產率可以提高一個數量級，并可大大降低勞動力消耗。
灌注培養主要可分為兩大類：懸浮灌注培養和床層培養。懸浮灌注培養是在普通懸浮培養的基礎上，加上一個細胞分離器而成，以微載體懸浮培養加旋轉過濾分離器最為常見。床層培養則把細胞直接保留于床層，不需要細胞分離器，其中堆積床和大孔載體培養的應用較廣。
2、灌注培養方法
在灌注培養前，對動物細胞的生長和生理特性進行充分的考察，是十分必要的，能為灌注培養提供有益的參考。以比生長速率為例，大量實驗表明，細胞的比生長速率降低時，產物的比生長速率提高，有人控制細胞的比生長速率為最大比生長速率的60%抗體生長速率增加了97%。灌注培養可以從兩個方面入手，一是改變動物細胞的培養環境，實行階段培養；二是進行代謝調控。
（1）階段培養
一般認為，動物細胞的培養條件應盡量模擬來源動物體內的條件，而且在培養中通常保持不變。而實際上，每種細胞的最適生長條件和最適產物生成條件是不同的。階段法培養就是根據這一點，把培養過程分為細胞生長期和產物生成期，分別采取不同的培養條件，以達到在細胞生長期使接種細胞大量繁殖，提高比生長速率，盡快獲得高密度細胞；在產物生成期保持細的高密度，維持存活率，降低細胞死亡速率，持續獲得高產率蛋白的目的。當產物蛋白對細胞有抑制時，階段培養尤見優勢。具體說來，可以用以下方法：
①pH值階段培養
對大多數動物細胞，培養液中合適的pH為7.2-7.4。低于6.8或高于7.6對細胞的生長都不利。近年來，對胞內pH的研究比較活躍。實驗發現胞內pH對細胞的代謝影響很大，胞內pH 降低0.2個單位，就足以使磷酸果糖激酶失活，抑制糖酵解途徑，使細胞的生長受阻；而胞內pH 升高0.2個單位，可以提高糖酵解速度50%。胞外pH 的降低和培養液中銨離子濃度的提高，都能引起胞漿酸化，胞內pH降低。有人把CO2的濃度由5%降為2.5%，胞內pH提高了0. 2個單位。胞內pH比胞外pH的檢測麻煩，所以還沒有廣泛應用。
②溶氧階段培養
不同細胞和同一細胞在不同生長時期對氧的需求均不相同.有人發現細胞生長的最適溶氧值為60%，但有人發現雜交瘤的最適溶氧為100%。一般說來，溶氧主要影響細胞的繁殖，而對產物的生成無直接影響，通過影響細胞生長間接起作用。通常在細胞生長初期控制溶氧的較低的水平，在對數生長期，當細胞達到較高的濃度時，提高溶氧水平；在產物生成期，應控制溶氧的適當水平。溶氧過高，細胞就會加速消耗營養物質，產生許多代謝產物。這些代謝產物對細胞有抑制作用，會大大降低細胞的存活率，降低產物的比生成速率。溶氧過低，細胞過氧的需求得不到滿足，依然會降低產物蛋白的產物。
③化學試劑誘導階段培養
如果構建的細胞上有可誘導基因，進入產物生成期后，就可以添加化學試劑對基因進行誘導，以實現目的基因的高表達，比如，將表達尿激酶原和二氫葉酸還原酶基因的兩個轉錄單位置于同一載體，分別受金屬硫(MT)和SV40早期啟動子控制，具有用氨甲喋呤(MTX)使基因擴增和利用金屬Zn2+誘導的雙重功能，有利于尿激酶的高表達。
細胞在細胞周期的不同時期，不僅蛋白的分泌速率不同，而且所分泌蛋白的類型和糖基化程度也可能不同。因此，研究并控制細胞的生理狀態很重要。然而，在細胞培養中，細胞生理狀態的檢測很麻煩。有人發現，細胞大小隨各時期變化很明顯，因此可以作電子細胞計數器就行了。分段培養應結合具體的培養條件進行。有些細胞的最適生長溫度和產物生成溫度相同，就不能進行溫度階段培養，而應尋找別的差異條件。在細胞生長期有的細胞可能會因比生長速率過大而產生非生產性細胞，這時就應控制比生長速率在一個適當的范圍。
（2）代謝調控培養
乳酸和氨是在培養過程中動物細胞產生的主要代謝產物，對細胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用。在分批培養和補料分批培養中的這一問題尤為突出。盡管灌注培養可以通過提高灌注速度來去除抑制產物。但是，一方面由于灌注培養細胞濃度很高，提高灌注速率，營養成分的供給十分充分，氨和乳酸的產生速率也增加了。另一方面，過高的灌注速率提高了細胞的比生長速率，降低產物的比產率，加上細胞對營養的利用并不徹底，培養液中會殘留大量的蛋白，造成提取純化的不便和培養基的浪費。所以，在培養中調控動物細胞的代謝途徑一直較受重視。通過代謝調控，可以減少副產物的產生，降低細胞的死亡速率，還可以控制灌注速率和培養液成分，控制細胞的狀態和比生長速率，以提高目標蛋白的產率。具體有以下方法：
①控制葡萄糖濃度法
乳酸濃度升高，會導致比生長速率降低，比死亡速率升高。乳酸的降低可更換葡萄糖為己糖如果糖或半乳糖，還可限制葡萄糖減少乳酸的生成，使初始葡萄糖濃度較低，在培養過程中再添加。在控制葡萄糖濃度法培養中，生長期可以使葡萄糖濃度稍高，以促進細胞生長；在產物合成期降低葡萄糖的濃度，降低乳酸的產生速率，避免乳酸的積累，減少毒害，降低死亡速率，維護持活細胞數在較高水平。同時還可以降低比生長速率，增加目標蛋白的產生速率。
灌注葡萄糖的同時，要間歇或連續地加入其他組分，以避免營養缺乏，其中谷氨酰胺要保持在較低水平，因為細胞的生長不依賴糖酵解，即使沒有葡萄糖，細胞仍可以通過降解谷氨酰胺獲得能量。假如谷氨酰胺的濃度過高，細胞就會偏向谷氨酰胺酵解，從而削弱這種方法的效果。由于葡萄糖的價格相對低廉，這種方法很有前途。
②控制谷氨酰胺法
上面提到，沒有葡萄糖，細胞可以利用谷氨酰胺作能量物質。因此，控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些，應用這一方法的報道也較多?？刂乒劝滨０窛舛鹊哪康?，主要是減少氨的產生。氨對細胞的毒性比乳酸大得多，表現為降低比生長速率，增加死亡速率。有人詳細地研究了動物細胞的代謝過程，采用底物限制補料分批工藝對動物細胞進行代謝控制。他采用這一方法，使氨的濃度降低了一半?？刂乒劝滨０贩ㄅc控制葡萄糖法一樣，要維持葡萄糖在較低水平。
③控制葡萄糖和谷氨酰胺法
在細胞中，葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝密切相關。葡萄糖消耗上升，則谷氨酰胺消耗下降，反之亦然。在相當大的一個范圍內，葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率與其濃度成正比。控制葡萄糖和谷氨酰胺法可降低乳酸和氨的產生，還能有效控制比生長速率。在細胞生長期，提供充分的營養，供細胞的需要；在產物合成期，降低葡萄糖和谷氨酰胺的濃度或流量，降低比生長速率，增加目標蛋白的產率。
④去除代謝產物法
通常使用透析膜，超濾臘或吸附劑選擇性去除乳酸、氨或銨離子。有人建議加化學試劑比如鉀鹽來消除氨的影響 ，也有人建議可使用有谷氨酰胺合成酶的細胞。
3、灌注培養的缺點
灌注培養發展到現在，還有許多急待解決的問題。其最大的缺點是培養基的利用不充分，造成一定的浪費。隨著細胞培養技術和產品分離技術的進一步發展，建立細胞培養與產物分離的耦合系統(圖2) ，能充分利用培養液，降低生產成本，一直是人們追求的目標，這里就不贅述。
五、動物細胞無血清培養技術
動物細胞無血清培養是生物科學領域中的重要研究課題之一。由于無血清培養基可以是完全采用已知分子結構和構型組分的低蛋白或無蛋白培養基。因而它不僅為研究和闡明細胞生長、增殖和分化的調節機制提供了有力的工具，而且為現代生物技術，尤其是細胞工程的應用準備了更好的條件。下面就動物細胞無血清培養基及其應用現狀做一概述：
1、動物細胞培養基的發展過程
（1）天然培養基階段
（2）合成培養基階段
（3）無血清培養階段
2、動物細胞培養中血清的作用
（1）提供有利于細胞生長增殖所需的激素、生長因子或提供合成培養基所缺乏的營養物質。
（2）提供可識別金屬、激素、維生素和脂質的結合蛋白，并通過與上述物質的結合而起到穩定和調節上述物質的作用。此外結合蛋白還可消除某些毒素和金屬對細胞的毒性作用。
（3）提供貼壁細胞固著于適當的附著面所需的貼壁因子和擴展因子。
（4）提供蛋白酶抑制劑，使細胞免受蛋白酶的損傷。
（5）提供 PH 緩沖物質，調節培養基PH。
（6）影響培養系統中的某些物理特性如：剪切力、黏度、滲透壓和氣體傳遞速度等。
3、動物細胞培養中血清可能引發的問題：
（1）在一些基礎研究中，往往影響實驗結果。
（2）血清中含有某些不利于細胞生長的毒性物質或抑制物質，對某些細胞的體外培養有去分化作用。
（3）血清中大量成分復雜的蛋白質給疫苗、細胞因子、單克隆抗體等細胞產品的分離純化帶來很大困難。
4、無血清培養基的組成及其主要補充成分
（1）激素和生長因子
（2）結合蛋白
（3）貼壁因子和擴展因子
（4）低分子量營養因子
5、無血清培養基的優點
（1）可避免血清批次間的質量變動，提高細胞培養和實驗結果的重復性。
（2）避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。
（3）避免血清組分對實驗研究的影響。
（4）有利于體外培養細胞的分化。
（5）可提高產品的表達水平并使細胞產品易于純化。
6、無血清培養基的缺點
主要表現為細胞的適用范圍窄，細胞在無血清培養基中易受某些機械因素和化學因素的影響，培養基的保存和應用不如傳統的合成培養基方便。
