內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1. .培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：
1 材料與方法
1．1 材料
1．1．1 新生兒臍帶 由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供。在無菌條件下，于健康產(chǎn)婦分娩后立即取新生胎兒臍帶。長度>20 cm，兩端扎緊投入到4℃臍帶保存液中，1 h內(nèi)送細(xì)胞培養(yǎng)室。
1．1．2 儀器與試劑倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化儀器廠)；5％C02培養(yǎng)箱(美國Heraeus公司)；離心機(jī)(上海安亭儀器廠)；25cm2培養(yǎng)瓶、六孔培養(yǎng)板(美國CA)star公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；促內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物(ECGS)、M199培養(yǎng)基、I型膠原酶(美國Sigrna公司)；明膠、胰酶(美國A1Tlresco公司)；滅菌生理鹽水(錦州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院制劑室)；鼠抗人Ⅷ因子單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。
1．2 方法
1．2．1 試劑配制 ：(1)臍帶保存液：生理鹽水、葡萄糖100 mmoL／L、100 U／ml青霉素一100 U／m1鏈霉素。(2)磷酸鹽緩沖液(PBs)。(3)D―Hanks液。(4)0．1％ I型膠原酶：用PBS配制。(5)0．05％胰酶一0．02％ 乙二胺四乙酸二鈉鹽(ED―TA)溶液：用D―Hanks液配制。 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液：含20％胎牛血清、ECGS、肝素，100 U／m1青霉素一100 U／m1鏈霉素的M199培養(yǎng)基。(7)0．2％ 明膠：用PBS配制。以上試劑均過濾除菌。
1．2．2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)： 參照J(rèn)affe 和Lin S等方法并加以改進(jìn)。在無菌條件下取新生胎兒臍帶，長度>20 cm。剪去臍帶兩端和臍帶上有夾痕及血腫部分，盡量擠干凈臍帶內(nèi)血液。用生理鹽水沖洗臍帶表面至無血色。用輸血器內(nèi)接有穿刺器的軟管，找到臍靜脈，將軟管針頭一端插入臍靜脈，用止水夾固定，另一端接20 m1注射器，吸取PBS反復(fù)沖洗臍靜脈直至無血色液體流出為止；將臍帶另一端用止血鉗夾閉，向臍靜脈中灌入0．1％ I型膠原酶溶液，使之充盈，夾閉軟管，37℃水浴中孵育20 min，其間輕輕擠壓并旋轉(zhuǎn)臍帶，以使酶溶液充分接觸血管內(nèi)壁，然后將細(xì)胞一酶溶液收集于預(yù)先裝有溫培養(yǎng)液小三角瓶中。用2倍于消化液的溫PBS沖洗臍靜脈，一并收集于小三角瓶中，將細(xì)胞懸液裝入10 ml離心管，1 000 r／min離心10 min，棄上清，吹打懸浮，再次離心10 min，重懸細(xì)胞并接種于鋪有明膠的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5％ C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液，以后每隔2 d換液1次。
1．2．3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 當(dāng)原代細(xì)胞融合80％以上后，加入0．05％ 胰蛋白酶一0．02％EDTA 溶液消化，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞皺縮變圓、彼此分離時(shí)棄消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞懸液。1 000 r／min離心10 min，棄上清，制成單細(xì)胞懸液。此時(shí)可用0．5％臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算活細(xì)胞百分率，并以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10 個(gè)／ml，接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿，彼此融合成片時(shí)依上述方法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。