利用哺乳動物細胞表達外源蛋白的研究進展
哺乳動物細胞是表達具有天然活性蛋白的最佳宿主其優勢在于能正確有效地識別真核蛋白的合成、加工和分泌信號，識別和去除基因中的內含子，再經剪切加工成為成熟的mRNA，能準確地完成糖基化、磷酸化，形成鏈內和鏈間二硫鍵及蛋白水解等翻譯后加工過程，因而產生的完整抗體和天然抗體一樣，具有生物學活性，既可識別抗原又可激活補體系統。哺乳動物細胞易被重組的DNA轉染，經過篩選可得到轉化的細胞，具有遺傳穩定性和可重復性．表達的產物分泌到培養基中易于純化。利用哺乳動物細胞表達蛋白產物已廣泛應用于生物制品工業，如病毒疫苗、抗體、干擾素、免疫調節劑、激素、和生長因子等的大量制備。
1．哺乳動物細胞宿主的選擇
哺乳動物細胞表達外源蛋白最初是將抗體基因重新導人淋巴細胞中由病毒(如SV40)或lgG的啟動子增強子引導。產生的抗體具有相應的結合能力和數應功能，但表達量很低。常用的非淋巴細胞類有中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、小倉鼠腎(BHK)細胞、COS細胞、小鼠NSO胸腺瘤細胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細胞等。不同宿主細胞表達的重組蛋白其穩定性和蛋白糖基化類型不同，需根據要表達的目的蛋白選擇最佳的宿主細胞。COS細胞是進行外源基因瞬時表達時用途最廣的宿主，其重組載件易于組建，便于使用，而且對插入DNA的量或者采用基因組DNA序列的情況都沒有什么限制，便于通過檢測表達情況來確證cDNA的陽性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突變。CHO細胞則利于外源基目的穩定整合，易于大規模培養，能在無血清和蛋白的條件下生比，是用于真核生物基因表達軟為成功的宿主細胞。已用于多種復雜的重組蛋白的生產，但其產量較低，一般僅占細胞蛋白的2.5%，而用細菌表達可獲得占總蛋白50%的蛋白表達水平，但大腸桿菌表達的動物蛋白能進行正確的翻譯后加工如糖基化和三維結構的形成，不具有與天然抗體相似的功能活性，且在人體內易于清除。如果需要表達具有生物學功能的膜蛋白或分泌型蛋白，例如細胞表面的受體或細胞外的激素和酶，則不能在原棱細胞中表達。而哺乳動物細胞表達的蛋白則具有天然蛋白的生物學活性。為提高哺乳動物細胞的蛋白表達量，需選擇合適的表達載體和有效的啟動子和增強子。
2．載體類型
哺乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質粒轉染和病毒載體的感染。利用質粒轉染獲得穩定的轉染細胞需幾周甚至幾個月時間，而利用病毒表達系統則可快速感染細胞，在幾天內使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達產物中檢測出目的蛋白。目前常用的可將目的基因導^哺乳動物細胞表達的病毒載體分為兩類：整合型如SV40病毒載體、反轉錄病毒載體和游離型如痘苗病毒、腺病毒載體。利用Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV)和痘苗病毒載體感染哺乳動物細胞表達的蛋白在結構與功能上與天然哺乳動物來源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒載體感染哺乳動物細胞獲得的外源蛋白占細胞總蛋白的。載體的選擇取決于外源基因的導人方式和其調控元件是否有利于轉錄和翻譯。真核生物基因高表達載體必須具有如下調控元件：①原核DNA序列，包括能在大腸桿菌中自身復制的復制子，便于篩選含螢組細菌的抗生素抗性基躅，以及便于目的基因插入的限制性酶切位點。目前采州的哺乳動物細胞表達戟體大都帶有來自pBR322的衍生質粒如pX[3、pBRd和pM[的原核序列；②啟動子和增強子；③剪接信號；④終止信號和poIyA加尾信號。為了將含目的基因的載體導入哺乳動物功物細胞．還必須加入遺傳選擇標記。常用的標記基因有胸腺激酶(tk)基因、二氫葉酸還原酶(dh]r)基因、新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基轉移酶(cat)基因等dhfr還可作為共擴增基因使外源基因的表達產物增加。當培養基中逐新增加氨甲蝶呤(MTX)的濃度時，隨著細胞對MTX抗體的增加。dhfr基因與外源基因均明顯擴增。據文獻報道，在不斷提高的選擇壓力下，dhfr及側翼序列能擴增至上千個拷貝，大大增加目的基因的表達水平。
3．載體元件
外源基因在哺乳動物細胞中的表達與多種因素有關，主要是啟動子和增強子的強弱以及它們之間的搭配。啟動子需包含兩個識別序列：mRNA轉錄起始點和TATA盒。TATA盒位于轉錄起始值點上游25--30bp處，是引導RNA聚合酶在正確起始位點轉錄所必需的序列，即保證轉錄的精確起始。其他上游啟動子元件常位于TATA盒上游100~200bp之間。其功能是調節轉錄的起始頻率和提高轉錄效率。啟動于和增強子受細胞類型的限制，在不同的細胞系中有很大不同，因此需根據宿主細胞的婁型選擇不同的啟動子和增強子以便于目的基因的高效表達。常用的啟動子有SV40、Rou肉瘤病毒RSV和巨細胞病毒CMV的啟動子。常用的增強子有Rous肉癯病毒基因長末端重復序列和人巨細胞病毒增強子。james等利用糖皮質類周醇誘導的鼠乳房瘤病毒(MMTV)啟動子和鼠乳房痛病毒長末端重復序列(MMTV-LTR)，在CHO細胞中表達分泌的堿性磷酸酶，產量為利用常規的SV40和CMV啟動子的10倍，超過0.4mg/ml。另外，在哺乳動物細胞中已發現存在大量在低氧環境中可誘導轉錄的基因，如編碼紅細胞生成素(EPO)轉鐵蛋白、血紅素加氧酶-1等的基因，它們都有一個共同的順式作用元件(CGTG)，有利于在5’或3’側翼區的低氧誘導低氧誘導作用因子-1(HIF-1)和低氧反應增強子(HRE)結合，激活靶基因的轉錄，在低氧濃度下可使重組蛋白大量表達。據報道紅細胞生成素啟動子在1%氧濃度比在21%氧濃度下活陛增強100倍。這又是一種新的提高表達量的作用機制。
4．提高蛋白表達產量的措施
哺乳動物細胞對培養環境十分敏感，營養和生長因子缺乏、缺氧、病毒感染、毒性代謝物的積累、機械攪動以及培養壓力的增加等很多固素都可誘導細胞凋亡。大量細胞的死亡嚴重影響蛋白的表達產量。現已證實，有些基因能抑制細胞凋亡，如Bcl-12和BcI-x能抑制許多因素誘發的細胞凋亡，以及某腫瘤細胞從貼壁培養轉入懸浮培養而誘發的細膽凋亡。A1ison等報道，感染dSsVCAT病毒載體的BHKBcl-12和CHOBcI-x細胞生存期均延長數倍。BHKBel2、HHKBcI-x均使感染SFVIIl!的細胞恢復生長到對數生長期的細胞感染后可存活達9d，LL12的產量提高一倍。有些化學制劑也能抑制不同階段的細胞凋亡，如乙酰半胱氨酸tNAC、吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC)等以及caspase抑制劑Z-VADfmk、YVAD，cmk等，從而大大增加表達蛋白的產量。如利用NAC和z-VADfmk的細胞培養，表達蛋白的產量分別提高2.2和3.9倍。細胞凋亡的抑制不僅延長細胞的存活期，提高蛋白的產量，而且有利于下游的純化過程。
在細胞大規模培育過程，細胞的持續大量增殖使蛋白表達很快進入衰退期。同時由于營養缺乏，細胞大量死亡使細胞產品的產量下降，死亡的細胞釋放蛋白酶和糖苷酶使表達產物降解，產品質量下降。為獲得產物的大量有效表達，必須控制細胞在達到最適表達產物期停止增殖。現已發現四環素抑制表達系統(Tctoff)可嚴格控制細胞增殖過程。外源基因和抑制細胞生長的基因(如P27)在同一個雙順反子表逸單位，在可稠節的啟動子(Totoff)作用下使細胞增殖期與增殖抑制產物表達期分開。細胞生長和產物表達都能達到最大程度。Totoff基因表達系統的優點在于毒性低，作用快，不影響哺乳動物細胞的代謝過程。由于四環素很不穩定，易于氧化脫水、芳香基化和表易構化作用，使Tot基因表達系統成為一個高效、無毒、具有嚴密開關功能(Trtswitch)的可誘導性基因表達系統，僅受四環素初濃度的影響，終產物中四環素自發降解，有利于下游的純化過程。這種Tel基因表達系統控制的蛋白表達方式，因使細胞生長期和產物袁達期分開而適用于生產使細胞具有代謝負擔或毒性的蛋白產物。mazur等報道利用該系統，在作用于細胞周期的激酶抑制子p27誘導下，使CHO細胞成功地達到持續生長抑制期，表達分泌型堿性磷酸酶SEAP(一種典型的外源糖蛋白)水平提高10~15倍。
在孵育批量培養中，通過減少葡萄糖和谷胱甘肽的量，使細胞代謝發生改變，以減少代謝產物乳酸、胺的形成，使細胞培養達到一種穩定狀態，細胞濃度和蛋白產物大大增加。
目前的生物工程要求使用第三代無血清培養基，即無血清無蛋白(或含量極低)的雙無培養基，使細胞培養很容易做到恒定，細胞分泌的的蛋白更易分離純化，培養基的成本大為下降。隨著基工程技術研究的深人，利用哺乳動物細胞表達蛋白產物的有效方式必將得到進一步發展，其在工業生產中的開發應用必將促進基因工程藥物的大量生產。
