流式細胞儀操作規程
目的：流式細胞儀開機程序、預設獲取模式文件、設定和調整、樣品分析、關機程序
一．開機程序
1．檢查穩壓器電源，打開電源，穩定5分鐘。
2．打開儲液箱，倒掉廢液,并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。打開壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿（一般可用三蒸水，做分選必須用PBS或FACSFlow），合上壓力閥。確實蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。
3．將FACSCalibur開關打開，此時儀器功能控制鈕的顯示應是STANDBY，預熱5－10分鐘。排出過濾器內的氣泡。
4．如果需要打印，打開打印機電源。
5．打開電腦,等待屏幕顯示出標準的蘋果標志。
6．執行儀器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的氣泡。
7．分析樣品時，先用FACAFlow 或PBS進行HIGH RUN約2分鐘。
8.做過分選后，每次開機后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個50ml離心管，不接通濃縮系統，摁下右下角白色按鈕開始沖洗。待自動停止后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。
二．預設獲取模式文件(Acquisition Template Files)
1．從蘋果標志中選擇CELLQuest見一個新視窗，可利用此視窗編輯一個獲取模式文件。
2．選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot，繪出一個或多個Dot Plots（點圖）。從Dot Plot對話框中選取Acquisition作為圖形資料來源，并確定適當的x軸和y軸參數
3．選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram，同上法可繪出Histogram（直方圖）。
4．將此視窗命名后儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夾中，下次進行相同實驗時可直接調用。
5.本計算機中已設定兩個模式文件：ACQ和EXP，儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夾中，ACQ用于細胞DNA檢測，EXP用于細胞表面標志分析。
三．用CELLQuest進行儀器的設定和調整
1．從蘋果畫面中選取CELLQuest，進入CELLQuest后在File指令欄中打開合適的獲取模式文件。
2．從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer（快捷鍵： ＋B）進行電腦和儀器的連機。將出現的Acquisiton Control對話框移至合適位置。
3．從Cytometer指令欄中，開啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四個對話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數據時隨時調整獲取條件。也可以用 +1，2，3，4獲得此四個對話框。
4．在Detectors/Amps對話框中，先為每個參數選擇適當的倍增模式(amplifier mode)：線性模式Lin或對數模式Log。
一般進行細胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細胞亞群時，FSC和SSC多以線性模式Lin測量，且DDM Param選擇FL2，而FL1, FL2與FL3則以對數模式Log測量；分析細胞DNA含量時，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin進行測量，且DDM Param選擇FL2；分析血小板表型時，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以Log進行測量。
5．放上待檢測的樣品，將流式細胞儀設定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。
6．在Acquisiton Control對話框中，選取Acquire，開始獲取細胞。在以下的儀器調整過程中隨時選取Pause，Restart以觀察調整效果。未完全調整好之前不要去掉SETUP前的“?”。
7．在Detectors/Amps對話框中，調整FSC和SSC探測器中的信號倍增度：PMT voltages（粗調）與Amp Gains（細調），使樣品信號出現在FSC-SSC點圖內,且三群細胞合理分布。
8．在Threshold 對話框中選擇適當的參數設定Threshold，并調整Threshold的高低，以減少噪音信號（細胞碎片）。一般做細胞表型時用FSC－H而做DNA時用FL2－H。Threshold并不影響檢測器對信號的獲取，但可改善畫面質量。
9．從屏幕左列繪圖工具中選取Region（區域），并在靶細胞周圍設定區域線，即通常所說的門。圈定合適的細胞群可使儀器調整更為容易。
10．Detectors/Amps對話框中，調整熒光檢測器（FL1, FL2, FL3, FL4等）的倍增程度。根據所用的熒光陰性對照樣品調整細胞群，使之分布在正確的區域內。
11．在Compensation對話框中，根據所用的調補償用標準熒光樣品調整雙色（或多色）熒光染色所需的熒光補償。比如應該為FL1+ FL2- 的細胞群卻分布在FL1＋ FL2＋區域內，則需調大FL2－？％FL1中的“？”，并從FL1-FL2點圖中觀察新的調整是否恰當
12．在Status對話框中可見：Laser Power:正常值―Run/Ready為14.7mW，Standby為5mW；Laser current:正常值為6Amps左右。
13．調整好的儀器設定可在Instrument Settings對話框中儲存，下次進行相同實驗時可調出使用，屆時只需微調即可。
14.本計算機中已有三個名叫儲存于FACStation G3 \BD Applications \CELLQuest Folder \IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files \CalibFile和Mast-Cell-Set的參數文件，前二者可用于分析人白細胞，后者用于分析小鼠肥大細胞。
四．通過預設的獲取模式文件進行樣品分析
1．從蘋果標志中選擇CELLQUEST，新視窗出現后從File指令欄中選擇Open，打開預設的獲取模式文件。
2．從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer進行電腦和儀器的連機。將出現的Acquisiton Control對話框移至合適位置。
3．從Cytometer指令欄中選取Instrument Settings，在其對話框中選擇Open以調出以前存儲的相同實驗的儀器設定，按Set 確定。
4．在Acquire指令欄中，選擇Acquisition&Storage決定儲存的細胞數，參數，信號道數。其中Resolution在做細胞表面標志時選擇256，做DNA時選擇1024。Parameter Saved…則根據不同的檢測對象選擇不同的參數。
5．在Acquire指令欄中，選擇Parameter Description，以決定文件存儲位置(folder)，文件名稱(file)，樣品代號以及各種參數的標記(panel)，即安排tube1，2，3…的檢測參數。一般本儀器獲取的數據按照檢測對象的不同分別儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \IMM 和DNA 文件夾中。文件根據日期命名。
6．在Cytometer指令欄中，選擇Counters，將此對話框移至合適位置，以便于隨時觀察events計數。
7．將樣品試管放至檢測區，在Acquire Control對話框中選取Acquire以啟動樣品分析測定。
8．微調儀器設定，待細胞群分布合適后選擇Acquire Control對話框中Pause, Abort, 去除Setup,開始正式獲取信號，存儲數據。
9．當一定數目的細胞被測定后，獲取會自動停止，并會自動存儲數據。重復步驟7，繼續分析下一個樣品，直到所有的樣品數據分析完畢。
10.當所有樣品分析分析完畢，即換上三蒸水，并將流式細胞儀置于“STANDBY”狀態，以保護激光管。
五．關機程序：
1．從File中選擇Quit, 退出軟件，選擇Don’t Save至蘋果屏幕。
2．用4ml 1：10稀釋的漂白水作樣品，將樣品置于旁位（vacuum is on），以外管吸去約2ml，在將樣品架置于中位（vacuum is off），再HIGH RUN 5分鐘（內管吸去2ml）。
3．改用三蒸水4ml作樣品,同上處理。
4．按Prime三次。
5．此時儀器自動轉為STANDBY狀態，換2ml三蒸水。必須在儀器處于“STANDBY”狀態 10分鐘后再依次關掉計算機、打印機、主機、穩壓電源，以延長激光管壽命，并確保應用軟件的正常運行。
6．填寫使用登記表。
