細胞示蹤熒光探針的基礎知識概述
細胞熒光探針北歐廣泛應用于測定細胞總量、干細胞體外實驗、追蹤活細胞行蹤，細胞熒光探針有許多種，由于篇幅原因這就主要介紹以下三種：細胞增殖示蹤熒光探針CFDA SE、活細胞熒光示蹤探針VFSE 450、DiI(細胞膜 紅色熒光探針)。
細胞增殖示蹤熒光探針 CFDA SE
CFDA SE的全稱為Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester，是一種近年來被廣泛應用的細胞增殖檢測用熒光探針 ，也可以用于細胞的熒光示蹤。
基于CFDA SE熒光標記的細胞增殖檢測和[3H]-thymidine摻入、BrdU標記獲得的檢測結果完全一致，但同時可以提供更多的細胞增殖信息。使用CFDA SE檢測可以提供整個細胞群中有多少比例的細胞分裂 了1次、2次或更多次數，同時如果和其它熒光探針聯用，可以獲取不同分裂次數細胞的其它相關信息。
CFDA-SE的分子式為C29H19NO11，分子量為557.47，CAS number為150347-59-4。CFDA SE可以通透細胞膜 ，進入細胞后可以被細胞內的酯酶(esterase)催化分解成CFSE，CFSE可以偶發性地(spontaneously)并不可逆地和細胞內蛋白的Lysine殘基或其它氨基發生結合反應，并標記這些蛋白。在加入熒光探針CFDA SE后大約24小時，即可充分標記細胞。被CFDA SE標記的非分裂細胞的熒光非常穩定，穩定標記的時間可達數個月。CFDA SE標記細胞的熒光非常均一，比以前使用的其它細胞示蹤熒光探針例如PKH26的熒光更加均一，并且分裂后的子代細胞的熒光分配也更均勻。
由于CFDA SE標記細胞的熒光非常均勻和穩定，每分裂一次子代細胞的熒光會減弱一半，這樣通過流式細胞儀檢測就可以檢測出沒有分裂的細胞，分裂一次的細胞(1/2的熒光強度)，分離兩次的細胞(1/4的熒光強度)，分裂三次的細胞(1/8的熒光強度)以及類似的其它分裂次數的細胞。采用CFDA SE通過流式細胞儀檢測獲得的檢測結果參考右圖。每一個峰代表一種分裂次數的細胞，從右至左的峰通常依次為分裂0次、1次、2次、3次等次數的細胞。分裂次數較多后，分裂0次或1次等沒有分裂或分裂次數較少的細胞會逐漸減少直至檢測不到。
使用CFDA SE可以檢測分裂多達8次或更多次數的細胞增殖。
目前CFDA SE標記細胞后通常用流式細胞儀進行細胞增殖檢測。最常用于淋巴細胞的增殖檢測，也可以用于成纖維細胞、NK細胞等其它細胞的增殖檢測，甚至還可以用于細菌增殖的檢測。
CFDA SE標記細胞呈綠色熒光，檢測時的激發波長可以選擇488nm，此時的發射波長為518nm，使用流式細胞儀檢測時可以采用FL1 detection channel。CFDA SE標記的細胞也可以用熒光顯微鏡進行觀察。
CFDA SE標記的細胞無論在體外還是體內都不會使鄰近細胞染色。即CFDA SE熒光探針完成標記后不會從一個細胞轉移到鄰近細胞。
CFDA SE標記細胞僅需5-15分鐘即可完成。對于不同細胞，最佳標記時間需自行摸索。
CFDA SE可以使用無水DMSO(anhydrous DMSO)配制，配制濃度通常為2-10mM。配制好的溶液宜當天使用完畢，不宜長時間保存。CFDA SE標記細胞時的最終濃度通常為0.2-10μM或更高一些。
在工作濃度為5μM時，一個包裝的本產品共可以標記約1.8升的細胞。
活細胞熒光示蹤探針VFSE 450
熒光標記細胞已被廣泛證實可有效確定總細胞的數量和一個樣本中存在多少活細胞。流式細胞術結合熒光染色法是分析非均質細胞種群的有力工具。非熒光性的FDA和它的衍生物分子進入細胞后被胞內無特異性的酯酶所水解產生熒光。這些熒光產物只能積聚在具有完整細胞膜的細胞中。因此，死細胞無完整細胞膜不能被染色。FDA及其類似物(如CDCFDA)精細的跨膜動力學以及胞內水解特點與細胞功能相關，因此FDA標記可以通過熒光顯微鏡或者流式細胞儀來檢測細胞。然而，因為CFSE和它的熒光類似物與GFP或者FITC具有相同的激發光譜，因此CFSE和它的熒光類似物不能用于GFP轉染細胞或者FITC標記抗體的應用中。VFSE染料與CFSE功能相似，因為它們都包含酯酶切割和胺反應的SE基團。VFSE染料能用于多色反應，因為VFSE與CFSE和它的熒光類似物具有不一樣的激發和發射光譜， 因此可以用于GFP轉染細胞或者FITC標記抗體的應用中。
DiI(細胞膜紅色熒光探針)
DiI即DiIC18(3)，全稱為1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，是最常用的細胞膜熒光探針之一，呈現橙紅色熒光。DiI是一種親脂性膜染料，進入細胞膜后可以側向擴散逐漸使整個細胞的細胞膜被染色。
DiI在進入細胞膜之前熒光非常弱，僅當進入到細胞膜后才可以被激發出很強的熒光。DiI被激發后可以發出橙紅色的熒光，DiI和磷酯雙層膜結合后的激發光譜和發射光譜參考下圖。其中，最大激發波長為549nm，最大發射波長為565nm。
DiI的分子式為C59H97ClN2O4，分子量為933.88，CAS number為41085-99-8。
DiI可以溶解于無水乙醇、DMSO和DMF，溶解度約為1-2.5mg/ml。發現較難溶解時可以適當加熱，并用超聲處理以促進溶解。
DiI被廣泛用于正向或逆向的，活的或固定的神經等細胞或組織的示蹤劑或長期示蹤劑(long-term tracer)。DiI通常不會影響細胞的生存力(viability)。被DiI標記的神經細胞在體外培養的條件下可以存活長達4周，在體內可以長達一年。DiI在經過固定的神經元細胞膜上的遷移速率為0.2-0.6mm/day，在活的神經元細胞膜上的的遷移速率為6mm/day。
DiI除了最簡單的細胞膜熒光標記外，還可以用于檢測細胞的融合和粘附，檢測發育或移植過程中細胞遷移，通過FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)檢測脂在細胞膜上的擴散，檢測細胞毒性和標記脂蛋白等。
用于細胞膜熒光標記時，DiI的常用濃度為1-25μM，最常用的濃度為5-10μM。DiI可以直接染色活的細胞或組織，染色時間通常為5-20分鐘。對于固定的細胞或組織，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛進行固定，使用其它不適當的固定液會導致熒光背景較高。
這里僅僅列舉了細胞示探針的冰山一角，想了解更多的細胞探針可以點擊查看以下：癌癥研究探針 、熒光微管蛋白和微管蛋白探針 、肌動蛋白和肌動蛋白探針 、熒光細胞追蹤染料 、熒光白蛋白標記 、熒光細胞追蹤試劑 、熒光膜和脂質探針 、膜和脂質探針 、細胞器探針和染色劑 、信號傳導探針 。
