T細胞尼龍毛柱分離法

在研究體內及體外的免疫系統時，分離淋巴細胞群是一個關鍵步驟。因為現在市場上并沒有針對 B 細胞的特異性抗血清，所以分離淋巴細胞中的 T 細胞并不是十分方便。 T 細胞尼龍毛分離法利用了尼龍毛對 B 細胞的親和力，從而使 T 細胞在沒有嚴重損傷的情況下達到的足夠的純度。因為這個方法不像流式和磁珠費用昂貴，而且操作簡便，所需要的條件也不高，是一種非常實用的方法。
( 在此我向各位解釋一下，現在分離 T 細胞的方法主要是三種，流式，磁珠法，尼龍毛法。與前兩種方法相比，尼龍毛法的優勢在于無需特定的設備儀器，一般的實驗室均有條件操作；價格相對低廉；可以進行大量樣本操作。 )
首先要指出的是實驗中所使用的是分離 T 細胞專用的尼龍毛 (Nylon Fiber) ，不是化工上的尼龍纖維，曾經有人問過我這種問題，如果你買錯了，可是做不出來的！其次，現在市面上的尼龍毛也是良雋不齊，也有同仁反應買到的尼龍毛加入緩沖液以后成了一團糨糊，根本沒法使用，這個問題就要靠各位的慧眼了。
現在市面上有尼龍毛填料，也已經有了商品化的尼龍毛柱子，這兩者的區別主要是以下兩點：
1. 商品化的柱子的填料量是已經定好的，有一個確定的上樣量范圍。而自己買填料裝柱可以控制填料量，也就是可以控制上樣量，這對于樣本量非常少，或是樣本量非常大的實驗需求非常合適。
2. 商品化的柱子已經經過了無菌處理 ( 一般是輻射滅菌 ) ，而自己裝柱當然就要自己滅菌了。
3. 商品化的柱子在實驗的重復性上有著絕對的優勢。自己裝的柱子在填料的處理和裝柱的松緊等方面不容易控制，差異性的控制就看你的實驗技巧了。
操作方法：
1. 秤取 1.5g 尼龍毛裝入 20-30ml 玻璃或一次性注射器內 ( 要可以滅菌的 ) ，填料的體積控制在 15 毫升左右 ( 注射器上有標記，所以還是比較好控制的 ) ，因為尼龍毛的松緊關系到 T 細胞的回收率，所以要特別注意。注射器下端配接 5 厘米 左右長的帶有彈簧夾的橡皮管。
2. 加入大量的 PBS 平衡柱子后，用鋁箔包裹，并置于適當的容器內，高壓滅菌 15 分鐘。
（商品化尼龍毛柱以上步驟可以省略，經過無菌 PBS 平衡后直接進行下列步驟。）
3. 滅菌的尼龍毛柱垂直固定后放于超凈臺內，頂部以鋁箔覆蓋，避免污染。
4. 橡皮管，彈簧夾用無水酒精消毒后接注射器下端，打開彈簧夾調節流速在大約 3-4ml/min 。
5. 首先，加入 3-4 倍柱體的無血培養基平衡；隨后，之后加入相同體積的含有血清的培養基平衡（上述培養基都要預熱），最后等培養基頁面接近柱填料頁面時，關閉彈簧夾。
6. 樣本細胞懸浮液濃度控制在 5×108cells/ml 的，上樣量一般是 1/3-1/5 柱體積 ( 商品化的柱子一般都有推薦上樣量 ) 。樣品加入之后，再加入少量培養液，然后關閉彈簧夾。
7. 柱上覆蓋鋁箔，移置于消毒過的容器中， 37 ℃ 孵育 1 小時。此過程中柱子必須要保持垂直狀態。
8. 從培養箱中拿出柱子，置于超凈臺內，除去鋁箔。接上按照 4. 中的方法消毒的彈簧夾和橡皮管，加入適當體積經 37 ℃ 預熱的培養基，打開彈簧夾控制流速在 3-4 mL/min ，流出約 5ml 之后，流出的培養液基變得不透明，此時其中含有 T 細胞，收集這一部分培養基。
9. 基本上何時結束收集取決于流出液體中細胞的濃度，實際上，收集的量達到一個柱體積時就可以停止收集，因為即使收集更多的量，回收率幾乎不會增加。
10 。參考數據：

樣本：小鼠脾臟（ T 細胞含量在 30-40% ， B 細胞含量在 55-60% ）

細胞回收率： 13-25%

B 細胞污染率：小于 15%

樣本：大鼠脾臟（ T 細胞含量在 30-35% ， B 細胞含量在 55-65% ）

細胞回收率：大于 25%

B 細胞污染率：小于 15%

樣本：人或兔外周血

細胞回收率 : 20-30% ( 人 ) ； 25-35% ( 兔 )

B 細胞污染率：小于 5% ( 人、兔 )

（注）收集粘附于尼龍毛上的細胞時，將 T 細胞收集完畢后的尼龍毛在無菌操作的狀態下取出，轉移到適當的容器中，用鑷子小心的將尼龍毛松開，粘附的細胞可以洗到培養基中。或者將注射器芯插入注射器內，通過壓力使的粘附的細胞隨著液體流出。